ΟΙ ΜΟΡΙΑΚΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΣΤΗΝ ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΤΩΝ ΛΟΙΜΩΞΕΩΝ Βασιλική Πιτυρίγκα, Ιατρός Βιοπαθολόγος, Λέκτορας Μικροβιολογίας Ε.Κ.Π.Α. .:

Παρουσίαση με θέμα: "ΟΙ ΜΟΡΙΑΚΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΣΤΗΝ ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΤΩΝ ΛΟΙΜΩΞΕΩΝ Βασιλική Πιτυρίγκα, Ιατρός Βιοπαθολόγος, Λέκτορας Μικροβιολογίας Ε.Κ.Π.Α. .:"— Μεταγράφημα παρουσίασης:

1 ΟΙ ΜΟΡΙΑΚΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΣΤΗΝ ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΤΩΝ ΛΟΙΜΩΞΕΩΝ Βασιλική Πιτυρίγκα, Ιατρός Βιοπαθολόγος, Λέκτορας Μικροβιολογίας Ε.Κ.Π.Α. Email.: vpitiriga@med.uoa.gr

2 Ο ΡΟΛΟΣ ΤΟΥ ΚΛΙΝΙΚΟΥ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΚΟΥ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟΥ ΕΙΝΑΙ: Η ΑΜΕΣΗ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΚΑΙ ΑΞΙΟΠΙΣΤΗ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΤΟΥ ΛΟΙΜΟΓΟΝΟΥ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑ

3 ΣΤΟΧΟΙ ► Έναρξη αιτιολογικής θεραπείας ► Λήψη κατάλληλων μέτρων πρόληψης της διασποράς του λοιμογόνου παράγοντα

4 Με ποιες μεθόδους μπορεί να γίνει η διάγνωση μιας λοίμωξης από τον κλινικό μικροβιολόγο?

5 ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΤΗΣ ΛΟΙΜΩΞΗΣ Task of the method – to make the microorganism “visible” and “measureable” ► Άμεση μικροσκόπηση του παθολογικού υλικού (πυοσφαίρια-μικροοργανισμοί) ► Καλλιέργεια και απομόνωση του μικροοργανισμού ► Ορολογικές μέθοδοι ανίχνευσης ειδικών αντισωμάτων για τη λοίμωξη ► Μοριακές τεχνικές

6 Ποιοι είναι οι περιορισμοί της μικροσκόπησης ?

7 Μικροσκόπηση ► Περιορισμένη ειδικότητα και ευαισθησία ► Παρουσία μεγάλου αριθμού μικροβίων (10.000/mL βιολογικού υγρού) και δυνητικά μεγάλης ποικιλίας μικροβίων ► Δυσχερής η μορφολογική αναγνώριση/παράγοντας υποκειμενικότητας ► Απαιτείται εμπειρία

8 Ποιοι είναι οι περιορισμοί της καλλιέργειας ενός μικροοργανισμού?

9 Περιορισμοί της καλλιέργειας ► Δυσκολίες στην απομόνωση μικροοργανισμών οι οποίοι αναπτύσσονται δύσκολα (Mycobacterium tuberculosis, Kingella κλπ.) ή καθόλου. ► Αδυναμία απομόνωσης του παθογόνου αίτιου λόγω χορήγησης αντιμικροβιακής θεραπείας ► Αδυναμία διάγνωσης ιογενών λοιμώξεων

10 Ορολογικές μέθοδοι διάγνωσης ► Η εισαγωγή των ορολογικών αντιδράσεων έδωσε λύση σε αρκετές αλλά όχι σε όλες τις περιπτώσεις ► Εξαιρετική βοήθεια στη διάγνωση των ιογενών λοιμώξεων ► Περιορισμοί

11 Ποιοί είναι οι περιορισμοί της ορολογικής διάγνωσης ?

12 Περιορισμοί της ορολογικής διάγνωσης ► Απουσία αντισωμάτων στην αρχική φάση της νόσου ► Απαραίτητη η λήψη δύο δειγμάτων με διαφορά 15νθημέρου το ένα από το άλλο ► Αδυναμία παραγωγής αντισωμάτων σε άτομα με ανοσοανεπάρκεια ► Εμφάνιση διασταυρούμενων αντιδράσεων ► Κατευθυνόμενη διάγνωση

13 Η εισαγωγή των μοριακών μεθόδων στην κλινική διαγνωστική έγινε κυρίως για να επιλυθούν οι αδυναμίες των συμβατικών μεθόδων, έτσι ώστε ο λοιμογόνος παράγων να ταυτοποιείται αξιόπιστα και έγκαιρα

14 Πότε ενδείκνυται η χρήση μοριακών μεθόδων? ► Ψευδώς θετικά ευρήματα με μικροσκόπηση-T.vaginalis, N.gonorrhoeae ► Ενδοκυττάρια παθογόνα– viruses, M.genitalium ► Χαμηλή ευαισθησία – Chlamydia sp.,Neisseria sp. ► Συχνοί οι οροθετικοί στον πληθυσμό– Chlamydia sp. ► Υποχρεωτικοί οι υπότυποι– HSV, HPV, HCV ► Αργή ανάπτυξη– M. tuberculosis

15 ► Μικροοργανισμοί πχ που εμφανίζουν δυσχέρειες με τις κλασσικές μεθόδους και που απομονώνονται εύκολα και μελετώνται γρήγορα με μοριακές τεχνικές: ► Το Μυκοβακτηρίδιο της φυματίωσης ► Ηπατίτιδα C ► Ανίχνευση γονιδίων αντοχής

16 Εφαρμογή των μοριακών τεχνικών στην κλινική διαγνωστική 1. Άμεση ανίχνευση παθογόνου μικροοργανισμού στο κλινικό δείγμα ► Διάγνωση λοιμώξεων που χαρακτηρίζονται από μικρό μικροβιακό φορτίο πχ. μηνιγγίτιδα ► Ανίχνευση λοιμογόνων παραγόντων που καλλιεργούνται δύσκολα ή καθόλου (μυκοβακτηρίδια, αναερόβιοι κλπ.) ► Εργαστηριακή διάγνωση ιογενών λοιμώξεων

17 Εφαρμογή των μοριακών τεχνικών στην κλινική διαγνωστική 2. Μοριακή ταυτοποίηση- τυποποίηση και ταξινόμηση άγνωστου μικροοργανισμού από καθαρό καλλιέργημα με βάση γενετικούς δείκτες. Εφαρμογή στην ταυτοποίηση μικροβίων που ομοιάζουν φαινοτυπικά (καλλιέργεια, βιοχημικές ιδιότητες κλπ.) πχ. με το μυκοβακτηρίδιο της φυματίωσης

18 Εφαρμογή των μοριακών τεχνικών στην κλινική διαγνωστική 3. Διερεύνηση των μηχανισμών αντοχής (ανίχνευση γονιδίων υπεύθυνων για αντοχή σε αντιμικροβιακά). 4. Κατανόηση της παθογένειας και της φυσικής ιστορίας των λοιμώξεων 5. Αντικατάσταση κλασσικών μεθόδων εργαστηριακής διάγνωσης. 6. Διαχωρισμός παθογόνων –μη παθογόνων στελεχών 7. Προσδιορισμός ιικού φορτίου 8. Διερεύνηση ενδονοσοκομειακών λοιμώξεων.

19 Βασικά Πλεονεκτήματα μοριακών τεχνικών ► Μεγάλη ειδικότητα ► Έγκαιρη διάγνωση λοιμώξεων πριν από την έναρξη των συμπτωμάτων (παρακάμπτουν τα ανοσολογικά «παράθυρα» λοιμώξεων πχ. HIV) σημαντική συμβολή στη θεραπεία ► Παρακολούθηση της πορείας της νόσου (ποσοτική PCR) ► Προσδιορισμός μεταλλάξεων που σχετίζονται με αντοχή σε φάρμακα ► Ευελιξία μεθόδου ► Ανίχνευση μικροοργανισμών και μετά την έναρξη θεραπείας ► Αντοχή στις συνθήκες μεταφοράς

20 Μειονεκτήματα των μοριακών τεχνικών έναντι των κλασσικών τεχνικών ► Στοχευμένη διάγνωση σε ένα παθογόνο ► Ψευδώς αρνητικά ► Εξειδικευμένο εργαστήριο/προσωπικό

21 Μειονεκτήματα των μοριακών τεχνικών έναντι των κλασσικών τεχνικών ► Επιμολύνσεις ► Υψηλό κόστος ► Εξειδικευμένο προσωπικό ► Κατάλληλος εξοπλισμός

22 Αδυναμίες των μοριακών διαγνωστικών μεθόδων ► Δεν προσδιορίζουν αν το γενετικό υλικό προέρχεται από ζώντα ή νεκρά μικροβιακά κύτταρα ► Δεν προσδιορίζουν αν το μικρόβιο που ανιχνεύθηκε αποτελεί το αίτιο της λοίμωξης ► Παρουσία ανασταλτικών παραγόντων

23 Μοριακή διάγνωση– Πως λειτουργεί? ►Κάθε οργανισμός περιέχει ορισμένο ΜΟΝΑΔΙΚΟ και ειδικό του είδους του DNA ►Οι μοριακές τεχνικές καθιστούν το ειδικό DNA ΟΡΑΤΟ 23

24

25

26

27

28

29

30

31

32

33

34

35

36

37 ► Restriction enzymes do not discriminate between DNA from different organisms ► Most restriction enzymes will cut DNA which contains their recognition sequence, no matter the source of the DNA Restriction endonucleases are a natural part of the bacterial defence system ► Part of the restriction/modification system found in many bacteria ► These enzymes RESTRICT the ability of foreign DNA (such as bacteriophage DNA) to infect/invade the host bacterial cell by cutting it up (degrading it) ► The host DNA is MODIFIED by METHYLATION of the sequences these enzymes recognise ▫Methyl groups are added to C or A nucleotides in order to protect the bacterial host DNA from degradation by its own enzymes

38 Οι μοριακές διαγνωστικές μέθοδοι διακρίνονται σε: ► Μη πολλαπλασιαστικές του μικροβιακού γενετικού υλικού (υβριδισμός) ► Πολλαπλασιαστικές του μικροβιακού γενετικού υλικού (Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης, PCR)

39

40 Γλωσσάριο ► Νουκλεοτίδιο: ένωση νουκλεικών οξέων με ένα σάκχαρο(πεντόζη)και φώσφορο ► Γονίδιο: μονάδα του DNA που κατέχει το γενετικό κώδικα σύνθεσης μιας πρωτείνης ► Denaturation: Διάσπαση ή αποδιάταξη της διπλής αλυσίδας του DNA ► Περιοριστικές ενδονουκλεάσες: Ένζυμα που πέπτουν ορισμένες αλληλουχίες νουκλεοτιδίων. ► Primer: Συγκεκριμένο κομμάτι αλληλουχίας νουκλεοτιδίων ενός DNA που χρησιμεύει σαν αφετηρία ή σαν εκκινητής για την έναρξη συνθέσεως αντίστοιχης αλληλουχίας ► Υβριδισμός του DNA: Συνένωση δύο συμπληρωματικών ελίκων διαφορετικής προέλευσης

41 Αρχή της PCR Σε κάθε κλινικό δείγμα που υπάρχει μικροοργανισμός υπάρχουν κομμάτια από το DNA του σε μικρή ποσότητα. Αν προκαλέσουμε τεχνητά τον πολλαπ/σμό του, μπορούμε να το ανιχνεύσουμε. Χρησιμοποιείται σε κλινικά δείγματα για ανίχνευση γενετικού μικροβιακού υλικού Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης, Polymerase Chain Reaction PCR (Kary B. Mullis 1983)

42 Βασικές αρχές της PCR Πολλαπλασιασμός ενός επιλεγμένου τμήματος μικροβιακού DNA Χρησιμοποιείται ένα ζεύγος (δύο είδη) εκκινητών (primers) που αντιστοιχούν στα άκρα του DNA στόχου. Το ένα ολιγονουκλεοτίδιο είναι συμπληρωματικό του 3’ άκρου του ενός κλώνου DNA και το άλλο ολιγονουκλεοτίδιο είναι συμπληρωματικό του 3’ άκρου του άλλου κλώνου DNA Ο κάθε κύκλος της PCR περιλαμβάνει τα παρακάτω στάδια: 1. Αποδιάταξη του DNA στόχου (θέρμανση 94-95οC) 2. Σύνδεση των εκκινητών στα άκρα του DNA-στόχου 3. Επέκταση των συμπληρωματικών αλυσίδων, με τη βοήθεια του ενζύμου Taq-πολυμεράση (κατεύθυνση 5’-3’)

43 Αντιδραστήρια ► Πολυμεράση Τaq DNA. Είναι ένα θερμοανθεκτικό ένζυμο και διατηρεί τη δραστικότητα της στους 80ο C. ► Αφετηρίες ή εκκινητές. ► Μικρές σειρές αλληλουχίας ειδικά για το DNA του κάθε μικροβίου, ιού ή άλλης γενετικής ύλης. ► Τριφωσφορικά δεσοξυνουκλεοτίδια (dNTPs) ► Ιόντα μαγνησίου

44 Απομόνωση νουκλεϊκών οξέων Διάσπαση των μικροβιακών κυττάρων Απελευθέρωση των πυρηνικών οξέων σε διαλυτή μορφή Προστασία των πυρηνικών οξέων από την αποικοδόμηση Διαχωρισμός των πυρηνικών οξέων, από κυτταρικά υπολείμματα και πρωτεΐνες και ένζυμα Συμπύκνωσή τους σε μικρό όγκο

45 Εκτέλεση μεθόδου 1η φάση ► Διάσπαση της διπλής έλικας του DNA του μικροβίου ή ιού σε δύο αλυσίδες (θερμοκρασία 95 ο C) 2η φάση ► Αγκίστρωση ζεύγους εκκινητών σε ένα σημείο της κάθε μιας από τις μονές αλυσίδες (θερμοκρασία 20 ο C-50 ο C)

46 Εκτέλεση μεθόδου 3η φάση ► Επέκταση των αφετηριών κατά μήκος της μονής αλυσίδας με τη δράση της πολυμεράσης-παραγωγή νέου κομματιού DNA ► Ο κύκλος αυτός γίνεται σε λίγα λεπτά και επαναλαμβάνεται 30 ή περισσότερες φορές …..διπλασιασμός κατά γεωμετρική πρόοδο (κατά 10 6 ) ► Το παραγόμενο DNA ηλεκτροφορείται και συγκεντρώνεται πάνω σε γέλη αγαρόζης ► Μέτρηση και ταυτοποίηση του με μεθόδους

47

48 Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης, Polymerase Chain Reaction PCR

49 Θερμικός κυκλοποιητής (PCR thermal cycler) ► Η όλη διαδικασία των κύκλων της θέρμανσης και της μείωσης της θερμοκρασίας προγραμματίζεται από ένα μηχάνημα το οποίο ονομάζεται θερμικός κυκλοποιητής (PCR thermal cycler) και το οποίο έχει τη δυνατότητα να αυξομειώνει την θερμοκρασία της αντίδρασης κάθε λίγα λεπτά ή δευτερόλεπτα, έτσι ώστε να επιτρέψει τη σύνθεση νέων τμημάτων DNA.

50 Θερμικός κυκλοποιητής (PCR thermal cycler)

51 Ηλεκτροφόρηση Το προϊόν της PCR που προκύπτει, ελέγχεται στην συνέχεια για το αν έχει όντως πολλαπλασιαστεί η αλληλουχία-στόχος. ► Ο έλεγχος γίνεται συνήθως σε ηλεκτροφόρηση πηκτώματος αγαρόζης με βρωμιούχο αιθίδιο (χρωστική που δεσμεύεται στο DNA και εμφανίζεται κάτω από υπεριώδες φως). ► Τα μόρια DNA, τα οποία είναι αρνητικά φορτισμένα, κινούνται μέσα στο ηλεκτρικό πεδίο και διαχωρίζονται ανάλογα με το μέγεθος τους. Όσα τμήματα έχουν το ίδιο μέγεθος σχηματίζουν μία ενιαία ζώνη. ► Η φωτογράφηση κάτω από υπεριώδες φως εμφανίζει μία έντονη ζώνη ορισμένου μήκους που αντιστοιχεί στην πολλαπλασιασμένη με PCR αλληλουχία.

52 Ηλεκτροφόρηση αντίδρασης PCR σε gel αγαρόζης Gel αγαρόζης (% αγαρόζης ανάλογα με αναμενόμενα κομμάτια DNA –bp) Προσθήκη στο gel αγαρόζης χρωστικής π.χ. βρωμιούχο αιθίδιο Χρήση UV

53

54 Real-Time PCR  Πρόκειται για μέθοδο PCR, όπου εκτός από τους εναρκτές διατίθενται και ειδικά φθοριωμένα probes μέσω των οποίων ανιχνεύεται, επιβεβαιώνεται και ποσοτικοποιείται το PCR- προϊόν σε πραγματικό χρόνο.  Καθώς δεν χρειάζονται επιπλέον διαδικασίες για την ανίχνευση του προϊόντος της αντίδρασης (gel, ηλεκτροφορήσεις κλ.) ο συνολικός χρόνος της διαδικασίας μειώνεται σημαντικά.

55 Συνδυασμός PCR και υβριδισμού Παρακολούθηση του νεοσυντιθέμενου προϊόντος κατά τη διάρκεια της PCR με τη χρήση ανιχνευτών σημασμένων με φθορίζουσες χρωστικές Δεν απαιτείται επιπλέον στάδιο ανίχνευσης του προϊόντος της αντίδρασης Ομογενής: ταυτόχρονος πολλαπλασιασμός και ανίχνευση του προϊόντος Κινητική: παρακολούθηση της αντίδρασης σε κάθε κύκλο Ποσοτικός προσδιορισμός των πυρηνικών οξέων Διάκριση μεταξύ μικροβίων ή και στελεχών μικροβίων Ανίχνευση μεταλλαγών

56

57 ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ Ταχεία Μειωμένος κίνδυνος επιμολύνσεων Υψηλή ευαισθησία Υψηλή επαναληψιμότητα Παρακολούθηση της πορείας της νόσου

58 Υβριδισμός: Βασικές αρχές του ► Στηρίζεται στην συμπληρωματικότητα των βάσεων των πυρηνικών οξέων ► Ομοιότητα του βακτηριακού DNA με την αλληλουχία του ιχνηθέτη που έχουμε επιλέξει ► Χρησιμοποιείται για ανίχνευση-χαρακτηρισμό γενετικού μικροβιακού υλικού ► Εξαιρετική ειδικότητα ► Υπολείπεται σε ευαισθησία σε σχέση με την PCR

59 ΥΒΡΙΔΙΣΜΟΣ

60 Ανιχνευτής πυρηνικών οξέων (Probe) ► Πρόκειται για μονόκλωνο σημασμένο ολιγονουκλεοτίδιο, με το οποίο έχομε τη δυνατότητα να εντοπίζομε τη συμπληρωματική περιοχή-στόχο. Αυτό το οποίο θέλομε από ένα probe είναι να υβριδοποιηθεί ειδικά με μιαν αλληλουχία-στόχο, η οποία να είναι μοναδική για κάποιο μικρόβιο. Συνήθως η επιλογή του probe γίνεται έτσι, ούτως ώστε να μπορέσομε να προσδιορίσομε κάποιο γένος, είδος, στέλεχος ή κάποιο διατηρημένο γόνο.

61

62 Συνθήκες υβριδισμού 100% ομόλογες αλληλουχίες υβριδίζονται με ισχυρούς δεσμούς Όσο μικρότερη είναι η ομολογία των αλληλουχιών η σύνδεση είναι χαλαρότερη. Υψηλή ειδικότητα επιτυγχάνεται με αυστηρές συνθήκες ● Χαμηλή συγκέντρωση αλάτων ● Υψηλή συγκέντρωση φορμαμιδίου ● Υψηλή θερμοκρασία

63 ΥΒΡΙΔΙΣΜΟΣ ΥΓΡΗΣ ΦΑΣΗΣ Τόσο το υπό ανίχνευση πυρηνικό οξύ, όσο και το probe βρίσκονται σε διάλυμα ΥΒΡΙΔΙΣΜΟΣ ΣΤΕΡΕΗΣ ΦΑΣΗΣ Το υπό ανίχνευση πυρηνικό οξύ ακινητοποιείται σε στερεό υπόστρωμα. Ο ανιχνευτής βρίσκεται σε διάλυμα

64 Υβριδισμός σταθερής φάσης Αρχή: ► Παραλαβή DNA ή RNA από τα εξεταζόμενα μικροβιακά κύτταρα ► Κοπή του από περιοριστικές ενδονουκλεάσες ► Διάσπαση των διπλών αλύσεων (denaturation) ► Ηλεκτροφόρηση των τμημάτων σε γέλη αγαρόζης (οδεύουν με διαφορετική ταχύτητα) ► Υβριδισμός με συμπληρωματικό σεσημασμένο DNA ανιχνευτή που φέρει αλληλουχίες γνωστού μικροβιακού είδους ► Ανίχνευση των σημασμένων διμερών ΑΠΟΤΥΠΩΤΙΚΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ Southern Blot: Hλεκτροφόρημα κομματιών DNA Northern Blot: Hλεκτροφόρημα κομματιών RNA

65 Southern Blot Στάδια Απομόνωση πυρηνικού οξέος Πέψη με περιοριστικές ενδονουκλεάσες Ηλεκτροφόρηση σε γέλη αγαρόζης Μεταφορά σε φύλλο νιτροκυτταρίνης Προσθήκη σημασμένου ανιχνευτή (υβριδισμός) Ανίχνευση περιοχών υβριδισμού

66 Southern Blot

67

68

69

70

71

72 Σύγχρονο Κλινικό Μικροβιολογικό Εργαστήριο ► Εξοικείωση με τη χρήση των μοριακών τεχνικών ► Επιλογή και σχεδιασμός καταλληλότερης μεθοδολογίας, η οποία κατά κύριο λόγο εξαρτάται από το κλινικό δείγμα ► Εμπορικά kits, in house μέθοδοι ► Περιορισμός του κόστους, ασφάλεια

73