ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΚΗ ΧΛΩΡΙΔΑ ΑΝΑΖΗΤΗΣΗ ΜΙΚΡΟΒΙΩΝ ΑΜΕΣΗ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ (ΧΡΩΣΗ Gram) ΕΜΜΕΣΗ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ (ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΑΝΤΙΓΟΝΟΥ ΜΙΚΡΟΒΙΩΝ) Γ. Καπαρός Επίκουρος Καθ. Μικροβιολογίας.

Παρουσίαση με θέμα: "ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΚΗ ΧΛΩΡΙΔΑ ΑΝΑΖΗΤΗΣΗ ΜΙΚΡΟΒΙΩΝ ΑΜΕΣΗ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ (ΧΡΩΣΗ Gram) ΕΜΜΕΣΗ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ (ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΑΝΤΙΓΟΝΟΥ ΜΙΚΡΟΒΙΩΝ) Γ. Καπαρός Επίκουρος Καθ. Μικροβιολογίας."— Μεταγράφημα παρουσίασης:

1 ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΚΗ ΧΛΩΡΙΔΑ ΑΝΑΖΗΤΗΣΗ ΜΙΚΡΟΒΙΩΝ ΑΜΕΣΗ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ (ΧΡΩΣΗ Gram) ΕΜΜΕΣΗ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ (ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΑΝΤΙΓΟΝΟΥ ΜΙΚΡΟΒΙΩΝ) Γ. Καπαρός Επίκουρος Καθ. Μικροβιολογίας Υπεύθυνος Εργαστηρίου Μοριακής Διάγνωσης Αρεταίειο Νοσοκομείο

2 Φυσιολογική χλωρίδα (Φ.Χ) Τα μικρόβια που αποικίζουν τον ανθρώπινο σώμα κατά τη γέννηση και λίγο μετά, παραμένουν για το υπόλοιπο της ζωής και ονομάζονται ΦΧ. Η ΦΧ εντοπίζεται σε διάφορα σημεία του σώματος. Υπάρχουν περιοχές του σώματος όπως ο εγκέφαλος, το κυκλοφοριακό σύστημα, οι μύες, οι πνεύμονες κ.α. οι οποίες έχουν σχεδιαστεί να παραμείνουν ελεύθερες μικροβίων.

3 Το έμβρυο στη μήτρα είναι ελεύθερο μικροβίων. Κατά τον τοκετό το νεογνό έρχεται σε επαφή με τους γαλακτοβάκιλλους από τον κόλπο της μητέρας → οι γαλακτοβάκιλλοι αποτελούν τον επικρατέστερο μικροοργανισμό της εντερικής χλωρίδας των νεογνών. Στη συνέχεια, με την αναπνοή και την σίτιση, περισσότερα μικρόβια εισέρχονται στο σώμα των νεογνών (π.χ. E.coli και άλλα μικρόβια από τις τροφές θα αποικίσουν το έντερο για το υπόλοιπο της ζωής). Και άλλοι μικροοργανισμοί, συνήθως ακίνδυνοι, θα αποικίσουν το ανθρώπινο σώμα είτε εσωτερικά είτε εξωτερικά. Το σώμα μας περιέχει περίπου 1 x 10 13 κύτταρα ενώ τα μικροβιακά κύτταρα που φιλοξενούμε είναι 10 φορές περισσότερα (10 14 ). Σε αυτά συμπεριλαμβάνεται η φυσιολογική μικροβιακή χλωρίδα αλλά και η παροδική μικροβιακή χλωρίδα - μικρόβια που εμφανίζονται για λίγες μέρες, εβδομάδες ή και μήνες και μετά εξαφανίζονται.

4 Γενικά, οι μικροοργανισμοί δεν αποικίζουν ολόκληρο το ανθρώπινο σώμα αλλά εντοπίζονται μόνο σε περιοχές στις οποίες μπορούν να προσλαμβάνουν τα απαραίτητα θρεπτικά συστατικά για τον πολλαπλασιασμό τους: –δέρμα –μάτια (επιπεφυκότας) –ανώτερο αναπνευστικό (ρινοφάρυγγας) –στοματική κοιλότητα –γαστρεντερικό σύστημα –ουρογεννητικό σύστημα

5 Αριθμός βακτηρίων που αποικίζουν τα διάφορα σημεία του σώματος. Οι αριθμοί αντιπροσωπεύουν των αριθμό μικροοργανισμών ανά γραμμάριο ομογενοποιημένου ιστού ή υγρού, ή ανά τετραγωνικό εκατοστό δέρματος.

6 Παράγοντες που επηρεάζουν τη Φ.Χ ΔιατροφικοίΔιατροφικοί: τα μικρόβια έχουν διαφορετικές διατροφικές απαιτήσεις για την ανάπτυξή τους. Ο αποικισμός εξαρτάται από το αν τα μικρόβια μπορούν να εξασφαλίσουν το υπόστρωμα που χρειάζονται. Φυσικοί και χημικοίΦυσικοί και χημικοί: t°, pH, παρουσία Ο 2, CO 2, NaCl, φως. Μηχανισμοί άμυναςΜηχανισμοί άμυνας: διάφορες ουσίες και ενεργοποιημένα κύτταρα οι οποίες εμποδίζουν την ανάπτυξη και την προσκόλληση των μικροβίων στα κύτταρα του ξενιστή και αδρανοποιούν τις τοξίνες που παράγουν. Μηχανικοί παράγοντεςΜηχανικοί παράγοντες: μηχανικές πιέσεις οι οποίες μπορούν να επηρεάσουν την ΦΧ –η μάσηση των τροφών με τα δόντια και οι κινήσεις της γλώσσας μπορούν να αποκολλήσουν τα μικρόβια που βρίσκονται στην επιφάνεια των δοντιών και στα ούλα –στο γαστρεντερικό οι εκκρίσεις και κινήσεις του οισοφάγου, στομάχου και εντέρων απομακρύνουν τα ελεύθερα μικρόβια –το ρεύμα των ούρων απομακρύνει τα ελεύθερα βακτήρια –στο αναπνευστικό σύστημα το κροσσωτό επιθήλιο απομακρύνει τα μικρόβια με τις κινήσεις τους.

7 Παράγοντες που επηρεάζουν τη Φ.Χ Υπάρχουν διαφορές στη ΦΧ από άνθρωπο σε άνθρωπο. Ανάμεσα στους παράγοντες που επηρεάζουν τη ΦΧ αναφέρονται: ηλικία διατροφικές συνήθειες υγεία νοσηλεία στρες κλίμα γεωγραφική θέση προσωπική υγιεινή συνθήκες διαβίωσης επάγγελμα άλλες συνήθειες

8 Δέρμα Στον ενήλικα το δέρμα καλύπτει μια επιφάνεια 2 τ.μ. Η ΦΧ εξαρτάται από την ανατομική θέση. Τα περισσότερα μικρόβια βρίσκονται στις πιο υγρές περιοχές, κυρίως στους ιδρωτοποιούς αδένες. Σε κάθε cm 2 του δέρματος ανευρίσκονται περίπου 3 εκατομμύρια μικροοργανισμοί. Πιο συχνά συναντάμε τα είδη Corynebacterium και Staphylococcus epidermidis. Τα χέρια και τα πόδια έχουν λιγότερα μικρόβια (1.000 – 10.000/cm 2 ), ενώ στο μέτωπο ανευρίσκονται μέχρι 1 εκατ/cm 2 και ανάμεσα στα δάχτυλα του ποδιού μέχρι 1.000 εκατ/cm 2.

9 Φ.Χ δέρματος 1.Staphylococcus epidermidis: > 90 % της αερόβιας χλωρίδας του δέρματος  βιομεμβράνη. 2. Staphylococcus aureus: δυστυχώς υπάρχει μεγάλη αύξηση των στελεχών ανθεκτικά σε αντιβιοτικά όπως είναι το MRSA (μεθικιλλίνη ανθεκτικός S. aureus) αλλά και VISA και VRSA (βανκομυκίνη). Συνήθως ο S. aureus θεωρείται παροδικός αποικιστής, όμως σίγουρα πρέπει να τον εντάξουμε στη ρινική χλωρίδα καθώς 86,9 εκατομμύρια άνθρωποι (32,4 % του πληθυσμού) είναι φορείς. 3. Corynebacterium diphteriae 4. Corynebacterium jeikeium 5. Propionibacterium acnes (αίτιο της ακμής) 6. Group A Streptococcus (S. pyogenes) 7.Pseudomonas aeruginosa: προκαλεί λοιμώξεις σε ασθενείς με εγκαύματα. Η παρουσία της στο δέρμα αναστέλλει την ανάπτυξη μυκήτων του είδους Candida.

10 S. epidermidis. Scanning EM. CDC. S. aureus. Gram stain. Corynebacterium diphtheriae, no longer a member of the normal flora. Methylene blue stain Pseudomonas aeruginosa growing on an agar plate. The most virulent Pseudomonas species produce mucoid colonies and green pigments such as this isolate. Propionibacterium acnes, found on skin and the conjunctiva. Micrococcus, commonly isolated from the skin and nasal membranes of humans.

11 Φ.Χ Ρινοφάρυγγα Κύρια Μέλη Μύτη: Μύτη: S. aureus – S. epidermidis – αερόβια διφθεροειδή Φάρυγγας: Φάρυγγας: S.aureus, S.epidermidis, διφθεροειδή, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus, Neisseria.Σχόλια: Ορισμένα μέλη της Φ.Χ είναι δυνητικά παθογόνα αλλά η δυνατότητά τους να προκαλούν λοίμωξη μειώνεται λόγω του μεταξύ τους ανταγωνισμού. Οι ρινικές εκκρίσεις καταστρέφουν ή αναστέλλουν την ανάπτυξη πολλών μικροβίων και η βλέννη καθώς και οι κινήσεις των κροσσών απομακρύνουν πολλά μικρόβια

12 Φ.Χ Στοματικής Κοιλότητας Κύρια Μέλη Στοματική Κοιλότητα: Στοματική Κοιλότητα: Streptococcus, Lactobacillus, Actinomyces, Bacteroides, Veillonella, Neisseria, Haemophilus, Fusobacterium, Treponema, Staphylococcus, Corynebacterium και CandidaΣχόλια: Η άφθονη υγρασία και ζέστη, καθώς και η σταθερή διαθεσιμότητα τροφής καθιστούν τη στοματική κοιλότητα ιδανικό περιβάλλον ανάπτυξης πολύ μεγάλων και ετερογενών βακτηριακών πληθυσμών στη γλώσσα, στις παρειές, τα δόντια και τα ούλα. Ωστόσο, η μάσηση, οι κινήσεις της γλώσσας και οι εκκρίσεις σιέλου απομακρύνουν πολλά μικρόβια. Ο σίελος περιέχει πολλές ανιμικροβιακές ουσίες.

13 Στόμαχος Από τον οισοφάγο η μικροβιακή χλωρίδα φτάνει μέχρι το στόμαχο μαζί με μικροοργανισμούς από την τροφή και τα υγρά. Ωστόσο, τα περισσότερα καταστρέφονται αμέσως από το όξινο pH (1,8 έως 2,5). Η συγκέντρωση των μικροοργανισμών στο στομάχι είναι περίπου 10³ CFU/ml και αποτελείται από: –Helicobacter pylori –Streptococcus –Staphylococcus –Lactobacillus –μύκητες –Peptostreptococcus –Fusobacterium –Bacteroides Τα Enterobacteriaceae και τα Clostridium απουσιάζουν.

14 Λεπτό έντερο Σε σύγκριση με το στόμαχο, το λεπτό έντερο αποτελεί έναν πιο φιλόξενο περιβάλλον. Ωστόσο, στο λεπτό έντερο τα μικρόβια έχουν να αντιμετωπίσουν μια άλλη πρόκληση — υψηλή ταχύτητα των ρευμάτων. Έτσι είναι πολύ δύσκολο να αποικιστεί το λεπτό έντερο καθώς τα μικρόβια παρασύρονται εύκολα από το ρεύμα των τροφών. Σαν αποτέλεσμα, η συγκέντρωση των βακτηρίων στο λεπτό έντερο είναι χαμηλή και κυμαίνεται γύρω στο 10 6 βακτήρια/ml. Η μικρή συγκέντρωση των βακτηρίων στο λεπτό έντερο φαίνεται να αποτελεί ένα αμυντικό μηχανισμό του οργανισμού μας για να αποφύγουμε τον ανταγωνισμό τον μικροβίων για τα πολύτιμα θρεπτικά στοιχεία όπως απλά σάκχαρα και πρωτεΐνες.

15 Παχύ έντερο Στο παχύ έντερο η ταχύτητα μειώνεται σημαντικά. Όταν στο λεπτό έντερο η τροφή χρειάζεται περίπου 3-5 h για να το διασχίσει, στο παχύ έντερο χρειάζεται 24-48 h. Αυτός ο αργός ρυθμός δίνει την ευκαιρία στα μικρόβια να αναπτυχθούν με έντονους ρυθμούς και να φτάσουν σε πολύ υψηλές συγκεντρώσεις (10 12 - 10 13 βακτήρια/ml). Τα βακτήρια αποτελούν το 35-50% του περιεχόμενου του παχέως εντέρου και σε έναν ενήλικα ζυγίζουν περίπου 1 κιλό. Στο παχύ έντερο τα βακτήρια συμμετέχουν στον τελικό στάδιο της πέψης με την διάσπαση των πολυσακχαριτών σε πιο απλές μορφές, αντίδραση η οποία δεν μπορεί να πραγματοποιηθεί από ανθρώπινα ένζυμα. Στον αναπτυγμένο κόσμο όπου τα θρεπτικά συστατικά είναι σε αφθονία η διάσπαση των πολυσακχαριτών δεν είναι αναγκαία για την επιβίωση. Αντίθετα, όπου τα θρεπτικά συστατικά είναι λιγοστά και ο πληθυσμός καταναλώνει τροφές πλούσιες σε πολυσακχαρίτες από τα φυτά, ή δράση της Φ.Χ είναι ζήτημα ζωής και θανάτου.

16 Αν και η E. coli είναι το μικρόβιο που έχει μελετηθεί καλύτερα από όλα και τώρα ξέρουμε την εντόπιση και την αλληλουχία των 4.288 γονιδίων στο χρωμόσωμα, ακόμα δεν γνωρίζουμε πλήρως τις σχέσεις της με τον ξενιστή-άνθρωπο. Colonies of E. coli growing on EMB agar.

17 Φ.Χ Ουρογεννητικού Συστήματος Κύρια Μέλη Escherichia coli, Bacteroides, Fusobacterium, Lactobacillus, Enterococcus, Bifidobacterium, Enterobacter, Citrobacter, Proteus, Klebsiella, Candida,Σχόλια: Το κατώτερο τμήμα της ουρήθρας και των δύο φύλων έχει φυσιολογική χλωρίδα. Η φυσιολογική χλωρίδα του κόλπου αποτελείται ως επί το πλείστον από μικρόβια ανθεκτικά σε όξινο περιβάλλον. Η βλέννη και οι περιοδικές κινήσεις του επιθηλίου αποτρέπουν την προσκόλληση μικροβίων στα τοιχώματα. Η ροή των ούρων απομακρύνει τα μικρόβια με μηχανικό τρόπο, ενώ το όξινο pH των ούρων και η ουρία έχουν αντιμικροβιακή δράση. Οι κροσσοί των κυττάρων και η βλέννη απομακρύνουν τα μικρόβια από τον τράχηλο της μήτρας προς τον κόλπο και το όξινο περιβάλλον του κόλπου καταστέλλει ή καταστρέφει πολλά βακτήρια.

18 Σχέση Φ.Χ - Ξενιστή 1.Προσσιτισμός (Commensalism) κατά τον οποίο ο ένας οργανισμός επωφελείται και ο άλλος μένει ανεπηρέαστος. Π.χ. Η Φ.Χ αναστέλλει τον αποικισμό του ξενιστή από δυνητικά παθογόνους μικροοργανισμούς με α) ανταγωνισμό για θρεπτικές ουσίες β) παραγωγή ουσιών που εμποδίζουν τον πολλαπλασιασμό των εισβολέων (βακτηριοσίνες από E.coli έναντι Salmonella + Shingela στο έντερο) γ) επηρεάζοντας το pH και τη διαθεσιμότητα του οξυγόνου (pH < 4 αναστέλλει την υπερανάπτυξη της Candida albicans) 2.Ωφέλιμη συμβίωση (mutualism) κατά την οποία ωφελούνται ταυτόχρονα και οι δύο οργανισμοί. Π.χ.: Η E.coli στο έντερο συνθέτει βιταμίνη Κ και βιταμίνες του συμπλέγματος B που χρησιμοποιούνται μέσω της κυκλοφορίας από τα κύτταρα του ξενιστή. Σε αντάλλαγμα το παχύ έντερο παρέχει στα βακτήρια θρεπτικές ουσίες που εξασφαλίζουν την επιβίωσή τους. 3.Παρασιτισμός (parasitism) κατά τον οποίο ένας οργανισμός ωφελείται εις βάρος του άλλου. Π.χ. Πολλά από τα βακτήρια που προκαλούν λοιμώξεις είναι παρασιτικά.

19 Ευκαιριακώς παθογόνοι μικροοργανισμοί της Φ.Χ Ορισμός: Μικροοργανισμοί που συνήθως δεν προκαλούν λοίμωξη όταν εντοπίζονται στο φυσικό τους περιβάλλον στον οργανισμό υγιούς ατόμου αλλά μπορούν να προκαλέσουν λοίμωξη α) όταν βρεθούν σε άλλες θέσεις του σώματος σε διαφορετικό περιβάλλον β) όταν ο οργανισμός – ξενιστής είναι εξασθενημένος ή ανοσοκατεσταλμένος

20 Ευκαιριακώς παθογόνοι μικροοργανισμοί της Φ.Χ. Αποστήματα Φαρυγγίτης, περιοδοντική νόσος Σήψης Ενδοκαρδίτις Πνευμονία Περιτονίτης και γαστροεντερίτης Ουρογεννητικές λοιμώξεις

21 Η διάγνωση μιας λοίμωξης επιτυγχάνεται μόνον με τους εξής 3 τρόπους: 1.Με την απομόνωση του παθογόνου μικροβίου από τον οργανισμό του ασθενούς: άμεση ανίχνευση των μικροβιακών κυττάρων σε κλινικό υλικό ανίχνευση αντιγόνων ή γενετικού υλικού του μικροβίου καλλιέργεια (επαγωγή) του μικροβιακού παράγοντα σε τεχνητά θρεπτικά υλικά ή πειραματόζωα

22 2.Με την απομόνωση σε κλινικό υλικό από τον οργανισμό του ασθενούς ειδικών μεταβολικών προϊόντων του μικροβίου που παράγονται, μόνον εφόσον ο μικροοργανισμός είναι παρών στον οργανισμό του ασθενούς και πολλαπλασιάζεται

23 3.Με την ανίχνευση στον ορό του αίματος του ασθενούς προϊόντων ειδικής ανοσολογικής ανταπόκρισης έναντι του παθογόνου μικροβίου (ΕΜΜΕΣΗ ή ΟΡΟΛΟΓΙΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ) για πρακτικούς λόγος ενδιαφέρουν κυρίως τα προϊόντα της χυμικής ανοσίας, δηλ. τα Αbs σε ξενιστή με φυσιολογικό ανοσοποιητικό σύστημα, σχεδόν κάθε λοίμωξη οδηγεί σε παραγωγή ΕΙΔΙΚΩΝ Abs έναντι συγκεκριμένων Ags του μικροβιακού αιτίου κυρίως ενδιαφέρουν και προσδιορίζονται τα ΕΙΔΙΚΑ Αbs IgM και IgG η ορολογική διάγνωση προσφέρει τα μέγιστα: στη διάγνωση μιας πρόσφατης λοίμωξης στη διάγνωση λοιμώξεων στις οποίες η απομόνωση του αιτιολογικού παράγοντα είναι δύσκολη ή πρακτικά αδύνατη (π.χ. ιοί, παράσιτα) στην παρακολούθηση της ανοσολογικής απόκρισης σε περίπτωση εμβολιασμού στην παρακολούθηση του θεραπευτικού αποτελέσματος

24 ΧΡΩΣΗ Gram ( Διαφορική Χρώση)

25 Τα βακτηρίδια που αποτελούν την Φ.Χ. αλλά και όσα αποτελούν εισβολείς είναι προκαρυωτικά κύτταρα δηλαδή το DNA τους δεν εγκλείεται σε πυρηνική μεμβράνη ενώ τα μόνα οργανίδια στο κυτταρόπλασμα είναι τα ριβοσώματα. Ανάλογα με το σχήμα τους χωρίζονται χονδρικά σε 3 βασικές μορφές: Τη σφαίρα ή κόκκο με χαρακτηριστικές τοποθετήσεις: Κατά σωρούς = σταφυλόκοκκοι Κατά αλύσους = στρεπτόκοκκοι Ανα δυάδες = διπλόκοκκοι (Neisseria gonorrhea). Τα ευθεία ραβδία = E. coli Τα καμπύλα ραβδία με μία καμπύλη (δονάκια) της χολέρας ή ελικοειδής καμπυλότητας (σπειροχαίτες) = σύφιλη (500 nm – 5000 nm) Το μέγεθος των βακτηριδίων κυμαίνεται από 0,5 – 5 μm και για να φανούν χρειαζόμαστε μεγέθυνση 500 – 1000 φορές. Για να τα παρατηρήσουμε στο μικροσκόπιο και να έχουμε μια πρώτη εικόνα χρησιμοποιούμε τη χρώση Gram η οποία είναι χρώση διαφοροποίησης και χωρίζει τα βακτηρίδια που χρωματίζονται σε δύο μεγάλες κατηγορίες τα Gram (-) και τα Gram (+).

26 Τα Gram (+) βακτήρια και οι μύκητες (ευκαρυωτικοί μικροοργανισμοί) απορροφούν το κρυσταλλικό ιώδες και χρωματίζονται μπλέ. Τα Gram (-) βακτήρια αποχρωματίζουν το κρυσταλλικό ιώδες με μείγμα οινοπνεύματος – ακετόνης, απορροφούν τη σαφρανίνη και χρωματίζονται κόκκινα. H διάρκεια της χρώσης είναι 3-4 min είναι εύχρηστη, οικονομική και επιτρέπει μια ποσοτική εκτίμηση βακτηρίων, πυοσφαιρίων και επιθηλίων σε κλινικό υλικό. Στα μειονεκτήματα θα αναφέρουμε ότι δεν χρωματίζει βακτήρια χωρίς κυτταρικό τοίχωμα όπως μυκοπλάσματα – χλαμύδια, ενώ το υπόστρωμα και τα κυτταρικά στοιχεία του ξενιστή χρωματίζονται κόκκινα με αποτέλεσμα τα Gram (-) βακτήρια να μην διακρίνονται σαφώς

27 Η διαφοροποίηση στον τρόπο χρώσης των βακτηρίων οφείλεται στη διαφορετική κατασκευή του τοιχώματός τους. Τόσο τα Gram (+) όσο και τα Gram (-) βακτήρια έχουν κυτταροπλασματική μεμβράνη που αποτελείται από διπλή στοιβάδα λιπιδίων μαζί με πρωτεΐνες. Εξωτερικά της διπλής στοιβάδας υπάρχει κυτταρικό τοίχωμα που αποτελείται από πολυσακχαρίτες (Ν-ακετυλογλυκοζαμίνης, Ν – ακετυλομουραμικό οξύ) και αμινοξέα. Το τρισδιάστατο πλέγμα που δημιουργείται ονομάζεται πεπτιδογλυκάνη ή μουρεΐνη. Στα Gram (+) βακτήρια το κυτταρικό τοίχωμα αποτελείται αποκλειστικά από αυτή τη στοιβάδα. Στα Gram (-) βακτήρια το τοίχωμα είναι πιο σύνθετο. Η στοιβάδα πεπτιδογλυκάνης είναι πιο λεπτή και εξωτερικά περιβάλλεται από εξωτερική μεμβράνη λιποπολυσακχαριτών και λιποπρωτεϊνών

28

29 ΤΕΧΝΙΚΗ Gram 1.Επίστρωση του παρασκευάσματος με κρίκο σε πλάκα 2.Στέγνωμα στον αέρα 3.Μονιμοποίηση σε φλόγα 4.Προσθήκη κρυσταλλικού ιώδους σε όλη την πλάκα (1 min) {Gram (+) μύκητες} Ξέπλυμα με Η 2 Ο και τίναγμα 5.Προσθήκη Lugol σε όλη την πλάκα (1 min) = σταθεροποιητής χρωστικής στη μικροβιακή μεμβράνη 6.Ξέπλυμα με Η 2 Ο 7.Προσθήκη του αποχρωματιστικού διαλύτη σε διαδοχικές φάσεις με ενδιάμεσο ξέπλυμα με Η 2 Ο μέχρις μακροσκοπικού αποχρωματισμού. 8.Προσθήκη σαφρανίνης σε όλη την πλάκα για 10 sec 9.Ξέπλυμα με και στέγνωμα κάθετα.

30

31

32 ΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΗ ΑΝΟΣΟΛΟΓΙΑ

33 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Ανοσοδοκιμασία (Immunoassay) ονομάζεται κάθε δοκιμασία (test) που χρησιμοποιεί την σύνδεση αντιγόνου – αντισώματος ως μέσο για την παραγωγή μετρήσιμου αποτελέσματος. Οι ανοσοδοκιμασίες διαφέρουν από άλλα tests που χρησιμοποιούνται στο εργαστήριο (π.χ. Χρωματομετρικά tests όπως αυτό για τη μέτρηση του σακχάρου) καθώς βασίζονται στη δημιουργία συμπλόκων αντιγόνου – αντισώματος και όχι στην χημική μετατροπή των προς μέτρηση ουσιών

34 Ανοσογόνα - Αντιγόνα - Αντισώματα - Αναλύτες Ανοσογόνα: ουσίες που μπορούν να προκαλέσουν παραγωγή αντισωμάτων. Επαγωγή δηλαδή ανοσολογικής απάντησης. Αντιγόνα: ουσίες που συνδέονται ειδικά με ένα μόριο αντισώματος Κάθε ανοσογόνο είναι αντιγόνο αλλά κάθε αντιγόνο δεν είναι ανοσογόνο Για λόγους απλότητος ανοσογόνα και αντιγόνα αναφέρονται συχνά ως αντιγόνα

35 Φύση αντιγόνων και ανοσογόνων Αντιγόνα μπορούν να είναι όλα τα βιολογικά μίκρο ή μάκρο μόρια Πρωτεΐνες Γλυκοπρωτεΐνες Λιπίδια Νουκλεϊκά οξέα Υδατάνθρακες Πολυσακχαρίτες Μέταλλα Οργανικές ενώσεις Μόνο τα μακρομόρια μπορούν να επάγουν ανοσολογική απάντηση (ανοσογόνα)

36 Φύση αντιγόνων και ανοσογόνων Αντίσωμα: Πρωτείνη η οποία παράγεται από τον οργανισμό ως απάντηση σε μια «εισβάλουσα» ξένη ουσία με σκοπό την αυτοπροστασία του και αποτελεί προϊόν της ανοσολογικής του απάντησης. Αναλύτης: Κάθε ουσία που μπορεί να μετρηθεί με ένα εργαστηριακό test. Στις ανοσοδοκιμασίες μπορεί να είναι αντιγόνο ή αντίσωμα. Αντιγονικός επίτοπος: Μικρή περιοχή του αντιγόνου που αναγνωρίζεται από αντίσωμα. Ένα αντιγόνο μπορεί να έχει πολλούς διαφορετικού ή επαναλαμβανόμενους επιτόπους.

37 Αλληλεπίδραση αντιγόνου - αντισώματος Εξαρτάται από 4 τύπους μη ομοιοπολικών δεσμών 1.δεσμούς υδρογόνου 2.ιοντικούς δεσμούς 3.υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις 4.αλληλεπιδράσεις van der Waals Σε υδατικό περιβάλλον οι μη ομοιοπολικές αλληλεπιδράσεις είναι εξαιρετικά ασθενείς και η ισχύς τους (affinity) εξαρτάται από τη συμπληρωματικότητα των σχημάτων του αντισώματος και του αντιγόνου. Ag + AbAg - Ab k1 k2

38 Affinity (Συγγένεια) Ενός αντισώματος ονομάζεται η συνδυασμένη ένταση μεταξύ ενός επιτόπου του αντιγόνου και μιας θέσης δέσμευσης του αντισώματος

39 Παραγωγή πολυκλωνικών αντισωμάτων Η διαδικασία παραγωγής αντισωμάτων ξεκινά όταν σε ένα ποντίκι ενίεται συγκεκριμένο αντιγόνο για την επαγωγή ειδικών αντισωμάτων. Στην περίπτωση που το αντιγόνο χαρακτηρίζεται από πολλούς διαφορετικούς επιτόπους και έχουμε επιτυχή ανοσοποίηση ο ορός από το αίμα του ποντικιού που ονομάζεται αντιορός θα περιέχει ένα μίγμα αντισωμάτων τα οποία αναγνωρίζουν και συνδέονται με το αντιγόνο αλλά το κάθε ένα σε διαφορετικό επίτοπο: πολυκλωνικά αντισώματα

40 Παραγωγή μονοκλωνικών αντισωμάτων Τα μονοκλωνικά αντισώματα διαφέρουν από τα πολυκλωνικά στο γεγονός ότι είναι παντελώς ειδικά για συγκεκριμένο επίτοπο του πολυδύναμου αντιγόνου καθώς παράγονται από μια κυτταρική σειρά με τεχνολογία: hybridoma technology και “mouse myeloma cell lines”. Μεγάλο πλεονέκτημα των μονοκλωνικών αντισωμάτων είναι ότι οι τελικές κυτταροκαλλιέργειες που τα παράγουν είναι θεωρητικά «αθάνατες»

41 ΕΠΙΛΟΓΗ ΥΒΡΙΔΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ The “Hat Trick” Τα κύτταρα μυελώματος με γενετική τροποποίηση δεν παράγουν το ένζυμο HGPRT, το οποίο είναι απαραίτητο για την επιβίωση τους (σύνθεση DNA) όταν καλλιεργηθούν στο μέσο HAT medium (Hypoxanthine – Aminopterin – Thymidine) Μόνο τα κύτταρα που έχουν συντηχθεί με τα κύτταρα σπληνός θα επιβιώσουν και θα πολλαπλασιαστούν

42 Μέθοδοι ανίχνευσης συμπλέγματος Ag - Ab 1.Αμεση βακτηριακή συγκολλητινοαντίδραση 2.Συγκολλητινοαντίδραση Latex 3.Αναστολή αιμοσυγκόλλησης 4.Μέθοδος εξουδετέρωσης 5.Ανοσοφθορισμός 6.Elisa 7.Κυτταρομετρία ροής Xmap Technology Incell DX

43 Άμεση βακτηριακή συγκολλητινοαντίδραση Ανίχνευση αντιγόνου το οποίο κατά κανόνα είναι μη διαλυτό (ολόκλητο μικροβιακό κύτταρο) με χρήση διαλυτών αντισωμάτων τα οποία τελικά συγκολλούν τα κύτταρα σε σωρούς Κυρίως για οροτύπηση μικροβίων μετά από καλλιέργεια (salmonella spp)

44 Π π.χ. αντισωμάτων έναντι CMV, RUB, T gondii, Μυκοπλασμάτων, ASTO κ.λ.π. π.χ. ανίχνευση β-αιμολυτικού στρεπτοκόκκου ομάδος Α σε 10 min Συγκολλητινοαντίδραση Latex. Σύνδεση Abs – Ags ένα εκ των οποίων έχει συνδεθεί τεχνητά στην επιφάνεια σωματιδίων latex: συγκόλληση σε μικροσκοπικά ορατές σώρούς

45 Αναστολή της αιμοσυγκόλλησης Παρατήρηση: οι διάφοροι ιοί συγκολλούν ερυθρά διαφορετικών ειδών, π.χ. ο ιός της ερυθράς συγκολλά ανθρώπινα ερυθρά ομάδας Ο, ερυθρά χήνας και ερυθρά κότας. * Αναστολή αιμοσυγκόλλησης για την ανίχνευση αντισωμάτων έναντι ιού. Αυτοί οι ιοί φυσιολογικά προκαλούν αιμοσυγκόλληση, όταν αναμιχθούν με ερυθρά αιμοσφαίρια. Αν υπάρχουν αντισώματα έναντι του ιού, όπως φαίνεται εδώ, τον εξουδετερώνουν και αναστέλλουν την αιμοσυγκόλληση.

46 Tests Εξουδετέρωσης Neutralization assays Αρχή: Αντισώματα στον ορό εξουδετερώνουν αντιγόνα στην επιφάνεια των ιών (neutralization antibdies) Συνεπώς ο ιός αδυνατεί να μολύνει κυτταρικές σειρές Οι δοκιμασίες αυτές θεωρούνται ως gold standard είναι εξαιρετικά απαιτητικές – χρονοβόρες (1 εβδομάδα) – κοστοβόρες και αφορούν μελέτη ιών που μπορεί να καλλιεργηθούν στο εργαστήριο Χρησιμοποιούνται για τον σχεδιασμό εμβολίων (επιλογή αντιγόνου  παραγωγή αντισωμάτων  έλεγχος των αντισωμάτων ως πρός την ικανότητα τους να εξουδετερώνουν τον ιό)

47 Μέθοδος Ανοσοφθορισμού Οι τεχνικές ανοσοφθορισμού χρησιμοποιούνται για την: Ανίχνευση μικροοργανισμών σε κλινικά δείγματα (άμεσος ανοσοφθορισμός ) Ανίχνευση ειδικών αντισωμάτων στον υπό εξέταση ορό (έμμεσος ανοσοφθορισμός). Στις τεχνικές αυτές γίνεται σύζευξη φθοριζουσών χρωστικών όπως η ισοθειοκυανική φθοριοσεϊνη με αντισώματα που φθορίζουν όταν εκτεθούν στο υπεριώδες φως. Μέθοδοι με υψηλή ευαισθησία και ειδικότητα

48 Το δείγμα που έχει το προς ταυτοποίηση αντιγόνο μονιμοποιείται σε αντικειμενοφόρο πλάκα. Στη συνέχεια προστίθενται αντισώματα σημασμένα με φθοριοσεΐνη – επώαση – απομάκρυνση περίσσειας αντισώματος Μέλέτη στο μικροσκόπιο. (Ανίχνευση χλαμυδίων σε ενδοτραχηλικό υγρό) Άμεσος ανοσοφθορισμός ανίχνευση αντιγόνου

49 ΕΜΜΕΣΟΣ ΑΝΟΣΟΦΘΟΡΙΣΜΟΣ – ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΩΝ: * Γνωστό αντιγόνο μονιμοποιείται σε πλάκα * Προσθήκη του υπό εξέταση ορού *Εάν υπάρχει ειδικό αντίσωμα έναντι του μικροβίου σχηματίζεται σύμπλεγμα *Για να γίνει ορατό το σύμπλεγμα αντιγόνου – αντισώματος προστίθεται στην πλάκα αντιανθρώπινη ανοσοσφαιρίνη σημασμένη με φθοριοσεΐνη. * ΕΛΕΓΧΟΣ ΣΤΟ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΟ Η αντιανθρώπινη ανοσοσφαιρίνη είναι αντίσωμα που αντιδρά με κάθε ανθρώπινη ανοσοσφαιρίνη

50 Μέθοδος Elisa Elisa: Enzyme – Linked Immunosorbent assay Η ευρύτερα χρησιμοποιούμενη ανοσοενζυμική δοκιμασία Αμεση Elisa: Προσδιορισμός αντιγόνων (φάρμακα, βhCG, HbsAg) Εμμεση Elisa: Προσδιορισμός αντισωμάτων (anti-HIV, anti HbS, anti-HCV, Rub IgG, Toxo IgG) Η Elisa με τη μεγαλύτερη ευαισθησία και ειδικότητα είναι η τύπου Sandwich Το αντίσωμα που χρησιμοποιείται έναντι του αντιγόνου (στην άμμεση elisa) ή έναντι του αντισώματος στην έμμεση elisa (αντιανθρώπειος ανοσοσφαιρίνη) είναι σημασμένο με ένζυμο (συνήθως βιοτίνη) το οποίο κατά την ένωση του με μόριο streptavidin HRP και παρουσία TMBH2O2 δίδει έγχρωμο προϊόν που μετράται σε φωτόμετρο. Με χρήση πρότυπης καμπύλης υπάρχει δυνατότητα όχι μόνο ποιοτικής μέτρησης αλλά και ποσοτικής.

51 Βιοτίνη + Στρεπταβιδίνη HRP TMB + H2O2

52

53 This standard curve is used to determine the unknown concentration of each sample by finding the opposite concentration to the absorbance Concentration ng/ml Absorption nm

54 ELISA Kit Results Clear Determination Of Positive And Negative Results

55