Απομόνωση DNA Mια πλήρης σειρά όλης της γενετικής πληροφορίας ενός ιού ή ενός κυττάρου αποτελεί το γονιδίωμα. Στα σωματικά κύτταρα ενός ευκαρυωτικού οργανισμού.

Παρουσίαση με θέμα: "Απομόνωση DNA Mια πλήρης σειρά όλης της γενετικής πληροφορίας ενός ιού ή ενός κυττάρου αποτελεί το γονιδίωμα. Στα σωματικά κύτταρα ενός ευκαρυωτικού οργανισμού."— Μεταγράφημα παρουσίασης:

1 Απομόνωση DNA Mια πλήρης σειρά όλης της γενετικής πληροφορίας ενός ιού ή ενός κυττάρου αποτελεί το γονιδίωμα. Στα σωματικά κύτταρα ενός ευκαρυωτικού οργανισμού κάθε χρωμόσωμα αντιπροσωπεύεται δύο φορές. Το μέγεθος ενός γονιδιώματος εκφράζεται συνήθως με τον αριθμό των ζευγαριών βάσεων, των νουκλεοτιδίων και διαφέρει σημαντικά στις διάφορες κατηγορίες των οργανισμών. Γενικά οι ιοί έχουν το μικρότερο γονιδίωμα, ακολουθούν τα βακτήρια και μετά οι ευκαρυωτικοί οργανισμοί. Το μέγεθος του ανθρώπινου DNA βρέθηκε ότι είναι 3 x 10⁹ βάσεις. Θα μπορούσε να συσχετιστεί και η πολυπλοκότητα του οργανισμού με το πλήθος των γονιδίων (περίπου 4.000 γονίδια στο βακτήριο και 33.000 γονίδια στον άνθρωπο).

2 Μέγεθος και δυναμικό κωδικοποίησης του DNA Επομένως οι ιοί θα πρέπει να κωδικοποιούν ένα μικρό αριθμό πρωτεϊνών, τα βακτήρια μερικές χιλιάδες και τα ευκαρυωτικά κύτταρα κωδικοποιούν ακόμα μεγαλύτερο αριθμό πρωτεϊνών. Η γενετική πληροφορία για όλες τις βιολογικές λειτουργίες ενός οργανισμού περιέχεται στην πρωτοδιάταξη του DNA. Το μέγεθος του γονιδιώματος δεν συνδέεται παρόλα αυτά με την «ανωτερότητα» του οργανισμού. Η μη ταύτιση της ποσότητας (μάζας) του DNA στο απλοειδές γονιδίωμα (τιμή C) με την φυλογενετική πολυπλοκότητα είναι γνωστή ως παράδοξο της τιμής C.

3 Σχέσεις μεγέθους γονιδιώματος και πολυπλοκότητας ενός οργανισμού

4 Μέγεθος γονιδιώματος Στους απλούστερους οργανισμούς το γονιδίωμα είναι πιο συμπαγές με τα γονίδια να βρίσκονται πολύ κοντά μεταξύ τους. Αντίθετα στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς, ένα μεγάλο ποσοστό DNA σχετίζεται με αλληλουχίες που απαντούν σε πολλαπλά αντίγραφα και ονομάζονται επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες (repetitive DNA sequences). To DNA αποτελεί μικρό μέρος των οργανικών συστατκών του κυττάρου (1,5 % της ξηρής μάζας). Tο DNA του πυρήνα ενός ευκαρυωτικού κυττάρου έχει μήκος 1.800 μm ενώ η διάμετρός του είναι περίπου 6 μm. Aυτό συμβαίνει γιατί το DNA συσπειρώνεται χιλιαδες φορές για να χωρέσει μέσα στο βακτηριακό κύτταρο ή στον πυρήνα του ευκαρυωτικού κυττάρου.

5 Ποσοστιαία αναλογία συστατικών βακτηριακού κυττάρου Συστατικά βακτηριακού κυττάρου% ξηρής μάζας Κυττάρικο τοίχωμα10 Πλασματική μεμβράνη10 DNA1.5 RNA20 Πρωτεϊνες55.5 Μικρομόρια3

6 Πειραματική διαδικασία Φτιάχνουμε 100 ml διαλύματος λύσης (5 ml Tris-HCl pH 7.5, 5 ml EDTA, 6 ml NaCl, 84 ml απεσταγμένο νερό). Το διάλυμα λύσης δίνει σταθερό περιβάλλον pH και επίσης επικαλύπτει το αρνητικό φορτίο του DNA έτσι ώστε τα τμήματα να έρθουν πιο κοντά (ελαττώνεται η άπωση). Κόβουμε ένα κρεμμύδι σε μικρά κομμάτια (περίπου 50-70 gr) και προσθέτουμε 100 gr λύσης. Ομογενοποιούμε με το blender για 45 δευτερόλεπτα σε χαμηλή ταχύτητα. Διηθούμε το ομογενοποίημα με διπλό τουλουπάνι και συγκεντρώνουμε το διήθημα (10 ml) σε σωλήνα τύπου Falcon. Προσθέτουμε 1 ml SDS (10 % v/v). To απορρυπαντικό προκαλεί διάρηξη της πλασματικής μεμβράνης και επίσης δρα ως γαλακτωματοποιητής για την κατακρήμνιση των λιπιδίων και των πρωτεϊνών. Τοποθετούμε το μείγμα σε πάγο για 5 sec.

7 Πειραματική διαδικασία Προσθέτουμε 15-20 ml αιθανόλη αργά με τη βοήθεια σιφωνίου, ώστε να σχηματιστεί ένα ευδιάκριτο στρώμα αιθανόλης πάνω από το ομογενοποίημα. Αφήνουμε το μίγμα σε ηρεμία για 3-5 λεπτά έως ότου το DNA να βγει εκτός διαλύματος και να γίνει ορατό με τη μορφή λευκών ινών. Με τη βοήθεια γυάλινης ράβδου μεταφέρουμε τις ίνες σε σωληνάκι τύπου falcon, προσθέτουμε 5 ml απεσταγμένου νερού και αποθηκεύουμε στους 4 ο μέχρι να χρησιμοποιηθεί.

8 Μέτρηση καθαρότητας του DNA Η καθαρότητα του DNA μετριέται με φασματοφωτόμετρο στο μήκος κύματος λ 260. Στη συνέχεια ρυθμίζουμε το μήκος κύματος της συσκευής στα 280nm. Τα νουκλεϊνικά οξέα (DNA, RNA) απορροφούν στα 260 nm, ενώ οι πρωτεϊνες στα 280 nm. Όταν ο λόγος (260/280) nm είναι μεταξύ 1.8-1.9, αυτό αποτελεί ένδειξη απομόνωσης DNA (υψηλής καθαρότητας), ενώ όταν η τιμή του λόγου είναι μεταξύ 1.9-2.0 αυτό αποτελεί ένδειξη απομόνωσης RNA (υψηλής καθαρότητας). Όταν η τιμή είναι αρκετά χαμηλότερη, τότε αυτό αποτελεί ένδειξη παρουσίας πρωτεϊνης, διότι οι πρωτεϊνες απορροφούν στα 280nm.

9 Λαµβάνοντας υπόψη ότι µια µονάδα οπτικής απορρόφησης (OD260 nm =1) αντιστοιχεί περίπου σε 50 µg/ml δίκλωνου DNA ισχύει ότι: C DNA = OD 260 nm x 50 x συντελεστής αραίωσης (ng/µl)