实验 54 E.Coli 感受态细胞的制备、质粒 DNA 的转化、提取与酶切鉴定 制作人：刘如石.

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1 实验 54 E.Coli 感受态细胞的制备、质粒 DNA 的转化、提取与酶切鉴定 制作人：刘如石

2 一. 实验目的和要求 1 、 通过本实验了解和掌握氯化钙法制备大肠杆菌感 受态细胞和质粒 DNA 转化受体菌细胞的原理与技术； 2 、了解质粒 DNA 的特性，掌握碱裂解法从大肠杆菌 细胞中分离、提取质粒 DNA 的方法； 3 、掌握限制性内切酶的特性、酶解和琼脂糖凝胶电泳 的操作方法； 通过本实验了解大肠杆菌感受态细胞制备、 DNA 转化、限制性内切酶在分子生物学研究中的意义与作 用。

3 二. 实验原理 1 、感受态细胞制备 : 所谓感受态是指受体细胞处 于容易吸收外源 DNA 的一种生理状态，可以通过物 理与化学方法诱导形成，也可以自然形成，在基因 工程技术中通常采用诱导的方法。用于转化的受体 菌细胞一般是限制 - 修饰系统（ Restriction- Modification ）缺陷的变异株，以防止对导入的外源 DNA 的切割，用符号 R - M - 表示。其基本原理是：细 菌处于 0 ℃的 CaCl 2 低渗溶液中，会膨胀成球形，细 胞膜的通透性发生变化，转化混合物中的质粒 DNA 形成抗 DNase 的羟基 - 钙磷酸复合物黏附于细胞表面， 经

4 过 42 ℃短时间的热激处理，促进细胞吸收 DNA 复合物， 在丰富的培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分 裂增殖，在选择培养基上可获得所需的转化子。 2 、碱裂解法小量制备质粒 DNA ：碱裂解法是基于 线性大分子染色体 DNA 与小分子环形质粒 DNA 的变性 复性的差异达到分离目的的，在 pH12.0 ～ 12.6 的碱性 环境中，线型染色体 DNA 和环型质粒 DNA 氢键会发生 断裂，双链解开而变性，但质粒 DNA 由于其闭合环型 结构，氢键仅发生部分断裂，而且其互补链不完全分 离；当将 pH 值调节到中性并在高盐浓度下，已分开的 染色体 DNA 互补链不能复性而交联形成不溶的网状结 构，通过离心，大部分染色体 DNA 、不稳定的大分子

5 RNA 和蛋白质 -SDS 复合物等一起沉淀下来而被除去，而 部分变性的闭合环状的质粒 DNA 在中性条件下很快复性， 恢复到原来的构型，呈可溶性状态保存与溶液中，离心 后上清中便含有所需要的质粒 DNA 。 根据限制酶的识别切割特性， 催化条件及是否具 有修饰酶活性可分为Ⅰ、Ⅱ、 III 型三大类，Ⅰ类和 III 类 限制性内切酶，在同一蛋白分子中兼有甲基化作用及依 赖 ATP 的限制性内切酶活性。Ⅰ类限制性内切酶结合于 特定识别位点，但却随机地切割回转到被结合 3 、限制性内切酶：又称为内切酶或限制酶，是一 类能识别双链 DNA 分子特异性核酸序列的 DNA 水解酶， 是体外剪切基因片段的重要工具，主要存在于原核生物 中。根据限制酶的识别切割特性， 催化条件及是否具 有修饰酶活性可分为Ⅰ、Ⅱ、 III 型三大类，Ⅰ类和 III 类 限制性内切酶，在同一蛋白分子中兼有甲基化作用及依 赖 ATP 的限制性内切酶活性。Ⅰ类限制性内切酶结合于 特定识别位点，但却随机地切割回转到被结合

6 处的 DNA 。Ⅲ类限制性内切酶在识别位点上切割，然后 从底物上解离下来。故Ⅰ类和Ⅲ限制酶在基因工程中基 本不用， II 类酶在分子克隆中使用广泛，其基本特点如 下： 处的 DNA 。Ⅲ类限制性内切酶在识别位点上切割，然后 从底物上解离下来。故Ⅰ类和Ⅲ限制酶在基因工程中基 本不用， II 类酶在分子克隆中使用广泛，其基本特点如 下： (1) 、专一性地识别并切割特定的核苷酸序列，如 EcoR I 识别与切割序列为 5`····GAATTC····3` (1) 、专一性地识别并切割特定的核苷酸序列，如 EcoR I 识别与切割序列为 5`····GAATTC····3` 3`····CTTAAG····5` 3`····CTTAAG····5` (2) 、识别的核苷酸数目大多数为 4 ～ 6 个，少数识别 8 ～ 13 个； (2) 、识别的核苷酸数目大多数为 4 ～ 6 个，少数识别 8 ～ 13 个； (3) 、识别序列大多数为二重对称（回文序列），大 多数酶产生的是具有凸出的粘性末端： (3) 、识别序列大多数为二重对称（回文序列），大 多数酶产生的是具有凸出的粘性末端：

7 (4) 、有不同来源的限制性内切酶可以识别相同的序列， 甚至切割的位点也相同，称为同裂酶或异源同工酶，如 Hpa II 与 Msp I ；有的识别位点不同，但对 DNA 切割后可 产生相同的粘性末端，称为同尾酶，如 BamH I 与 Bgl II 。

8 影响核酸限制性内切酶活性的因素 ： DNA 的纯度； DNA 的甲基化程度； 酶切消化反应的温度； DNA 的分子结构；溶液中离子浓度及种类； 缓冲液的 pH 值。 4 、琼脂糖凝胶电泳 : 琼脂糖溶化再凝固后能形成 带具有一定形状、大小与孔隙度的固体基质 ( 密度与琼 脂糖浓度相关 ) ；而生理条件下，核酸分子的糖 - 磷酸 骨架中磷酸基团呈离子化状态，因此将核酸分子置于 电场中时，它们会向正极迁移，由于糖 - 磷酸骨架在结 构上的重复性，相同数量的双链 DNA 几乎具有等量的 净电荷，因此他们能以同样的速度向正极方向迁移。 在一定的电场强度下， DNA 分子的迁移率取决于核酸 分子本身的大小和构象。分子量较小的 DNA 分子，比 分子量较大的 DNA 分子，具有较紧密的构型，所以其 电泳迁移速率也就比同等分子量的松散型的开环 DNA 分子或线性 DNA 分子要快。直接用低浓度的 EB 进行染

9 色，可确定 DNA 在胶中的位置。 影响琼脂糖凝胶电泳 DNA 迁移率的因素： DNA 的分子大小； 琼脂糖浓度； DNA 构象； 电场强度； 碱基组成与温度；嵌入染料的存在；电泳缓冲液的组成。 三．实验材料与设备： 1 、用品与与仪器： 超净工作台、电热恒温水浴、分光光度计、恒温培养箱、 恒温振荡器、移液器、微型离心管等、台式冷冻高速离心 机、旋涡震荡器、电泳仪、电泳槽、紫外透射仪，凝胶成 像仪、冰箱、制冰机等； 1.5mL 与 0.5mL Eppendorf 管、 tip 头 、烧杯、量筒

10 镊子、试管三角瓶、玻璃涂棒、酒精灯、无菌牙签、 吸水纸，一次性塑料手套等； E.coli DH5α 受体菌 (R - M - ) ， pGEX-PDIP-r 质粒 (AmpR) 2 、试剂： LB 培养基 : 蛋白胨 10g/L ，酵母提取物 5g/L ， NaCl 10g/L ，琼脂粉 15g/L （固体培养基），用 10 mol/L 的 NaOH 调节 pH 为 7.0 ，高压灭菌； 氨苄青霉素贮存液：浓度 50-100mg ／ mL ； 含有抗菌素的 LB 平板培养基：将配置好的 LB 固体培养 基高压灭菌后，冷却到 60 度左右，加入氨苄青霉素（终 浓度为 50µg ／ mL 浓度 50-100µg ／ mL ）；

11 0.1mol/LCaCl 2 ：称取 1.1g 进口无水 CaCl 2 ，溶于 70mL 双蒸水中，定容到 100mL ，过滤后灭菌； 0.1mol/LCaCl 2 15 ％甘油： 100ml 0.1mol/L CaCl 2 溶液内含有 15ml 甘油，高压灭菌； 溶液 I: 50mmol/L 葡萄糖， 10mmol/L EDTA (pH8.0) ， 25mmol/L Tris-HCl (pH8.0) ； 溶液 II: 0.2mol/L NaOH, 1%SDS ( 现配现用 ) ； 溶液 III: 乙酸钾溶液 (3M, pH=4.8)( 60mL 的 5mol/L KAc, 11.5ml 冰醋酸， 28.5mL H2O) ； RNase A ： 10mg/ml ； TE 缓冲液 : 10mmol/L ， Tris-HCl, 1mmol/L ， EDTA ， pH8.0 ；

12 5×TBE 缓冲液： 0.45mol/L Tris －硼酸， 0.01 mol/L EDTA, pH 8.0 ； 10×Loading buffer ： 1% SDS, 0.05% 溴酚兰， 50 ％ 的甘油； 无水乙醇； 70 ％乙醇； 标准分子量片段； 核酸内切酶 EcoR I (TaKaRa) ； EcoR I 酶解缓冲液 (10× buffer H) ； 琼脂糖； 溴化乙啶（ EB ）染色液 (10mg/ml) 。

13 四．操作步骤 : ( 一 ) 感受态细胞的制备： 1 、从新活化的 E.coli DH5α 平板上挑取一单菌落，接 种于 3 ～ 5ml LB 液体培养中， 37 ℃振荡培养至对数生长 期 ( 12h 左右 ) ； 2 、将该菌悬液以 1:100 ～ 1:50 转接于 100ml LB 液体培 养基中， 37 ℃振荡扩大培养，当培养液开始出现混浊后， 每隔 20 ～ 30min 测一次 OD 600 ，至 OD 600 为 0.3 ～ 0.5 时停 止培养，并转装到 1.5 mL 离心管中； 3 、培养物于冰上放置 20min ； 4 、 0 ～ 4 ℃， 4000g 离心 10min ，弃去上清液，加入 1 mL 冰冷的 0.1mo1 ／ L CaCl 2 溶液，小心悬浮细胞, 冰浴 20 分钟；

14 CaCl 2 纯度至关重要，不同厂家， 甚至同一厂家不同批号的产品均影响感受态的转化效率 5 、 0 ～ 4 ℃， 4000g 离心 10min ，倒净上清培养液， 再用 1.0 mL 冰冷的 0.1mo1 ／ L CaCl 2 溶液轻轻悬浮细胞， 冰浴 20min ； 6 、 0 ～ 4 ℃， 4000g 离心 10min ，弃去上清液，加入 100 µL 冰冷的 0.1mo1 ／ L CaCl 2 溶液，小心悬浮细胞， 冰上放置片刻后，即制成了感受态细胞悬液； 8 、制备好的感受态细胞悬液可直接用于转化实验，如 果在 4 ℃放置 12 ～ 24h ，其转化效率可以增高 4 ～ 6 倍；也 可加入占总体积 15 ％左右高压灭菌过的甘油，混匀后分 装于 1.5ml 离心管中，置于 -70 ℃条件下，可保存半年至 一年。

15 （二）质粒 DNA 的转化： 1 、每 100µL 感受态细胞悬液中加入 1µL 质粒 DNA, 轻轻 摇匀，同时设置三组对照： (1) 不加质粒， (2) 不加受体菌， (3) 加已知具有转化活性的质粒 DNA ，具体操作按下表进 行： * 阳性对照，用已知具有转化活性的 pGEX-PDIP-r 质粒 DNA 进行转化 编号 组 别 质粒 DNA/μL TE buf / μL 0.1mol/L CaCl 2 / μL 受体菌 / μL 1受体菌对照——1——100 2质粒对照 1 （ μg ） ——100 3 转化组 I 1 （ μg ） ————100 4 转化组 II * 1 （ μg ） ————100

16 2 、冰上放置 20 ～ 30min ，然后 42 ℃水浴热激 90 ～ 120 Sec ，迅速冰上冷却 2min ； 3 、 立即向上述 Ep 管中加入 0.8mL LB 液体培养基， 摇匀后于 37 ℃振荡培养约 15 ～ 30min ，使受体菌恢复正 常生长状态及表达抗性基因； 4 、取培养液 50µL 接种于含抗菌素的 LB 平板培养 基上，用玻璃涂棒涂匀； 5 、将培养皿放在 37 ℃恒温培养箱培养 30 min, 待菌 液完全被培养基吸收后，倒置培养皿，于 37 ℃恒温培养 箱内培养过夜 (14-16h) ； （三）碱裂解法小量制备质粒 DNA:

17 1 、挑取转化筛选的带有目的质粒的大肠杆菌接种到 液体培养基中， 37 ℃震荡培养 12 ～ 16 小时； 2 、将 1.5mL 菌液加入 Ep 离心管中， 12000 g 离心 30 Sec ，弃上清液，在吸水纸上扣干； 离心时间不能太长，以免影响下一步的菌体悬浮 3 、加入 100  L 预冷的溶液 I ，于涡旋振荡器上振荡 悬浮细菌细胞，尽量使细胞分散； 溶液 I 中的葡萄糖的作用是增大让一让的粘度，减少提取 过程中的机械剪切力，防止染色体 DNA 的断裂； EDTA 的作 用是与二价离子（ Ca 2 ＋ ）结合，降低 DNase 对 DNA 的降解。 4 、加入 200  L 新配制的溶液 II, 盖紧管口, 快速颠倒 离心管, 以混匀内容物, 冰上放置 3 － 5min; 溶液 II 中的 NaOH 与 SDS 可裂解细胞，使 DNA 变 性以及 SDS 使蛋白变性并形成交联的网状结构

18 5 、加入 150  l 溶液 III, 加盖后颠倒 6-7 次混匀，冰上放 置 2 ～ 3min ； 溶液 III 为低 pH 的醋酸钾缓冲液，中和 NaOH ，以便使部 分变性的闭环质粒复性，而细菌染色体 DNA 不能正确复性 6 、 12000 g 离心 6 min ，将上清移入另一干净的 Ep 管中； 7 、加 2 倍上清体积 ( 约 1mL) 的无水乙醇, 振荡混匀，室 温放置 2min. 8 、 12000g 离心 10min ，弃上清液，再用 70 ％的乙醇 洗涤一次， 12000g 离心 1min ，离心管倒置于吸水纸上 扣干，然后在中空浓缩系统上干燥质粒； 9 、加入 40  L 含 20  g/mL RNase A 的灭菌蒸馏水或 TE 缓冲液溶解提取物，室温放置直到质粒完全溶解 ( 约 8min) ，存于－ 20 ℃或直接用于酶切。

19 质粒图谱 :

20 ( 四 ) 提取质粒的酶切鉴定与琼脂糖凝胶电泳： 1 、在 0.5mL Ep 管中依次加入下列溶液于 0.5ml 离 心管中 提取质粒 DNA 3.0  L 10× buffer H 1.0  l EcoR I 2.0 U dd H2O 5.8  L 10  L 1U: 1 单位酶通常定义为，在建议缓冲液及温度下， 在 20  L 反应液中反应 1h ，使 1  g DNA 完全消化所需的酶量. 2 、 轻轻混匀, 4000g 离心 10 秒 ，置于 37 ℃水浴中 酶解 1.5h 。 3 、酶解完成后，加入 1.2  l 10× 上样缓冲液 ( 或 2  l 6× 上样缓冲液 ), 混匀. 4 、称取 1g 琼脂糖，置于三角瓶中，加入 100mL 0.5×TBE 或 1×TAE 缓冲液，瓶口倒扣一个小烧杯，将 该三角瓶置于微波炉加热直至琼脂糖溶解。

21 5 、将梳子放置在制胶槽上，在冷却至 60 ℃左右的 琼脂糖凝胶液加入一小滴 EB ，小心混匀，倒到制胶槽 上，直到在整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层，不 要产生气泡（厚度约为 3 ～ 4mm ）； 6 、 室温下静置 30min 左右，待凝固完全后，轻轻 拔出梳子。 7 、制好胶后将凝胶连同内槽放在含有 0.5×TBE 或 1×TAE 缓冲液的电泳槽中使用 ( 注意 : 电泳槽中的缓冲 液应与配胶用的缓冲液成分、浓度一致 ) 。 8 、用微量加样器将样品分别加入胶板的样品孔内 加完样后的凝胶板即可通电进行电泳（ 80 ～ 100V 的电 压下电泳，一般情况下，电压 / 电极间距离应小于 5V/cm ），当溴酚兰移动到距离胶板下沿约 1cm 处停止 电泳。

22 9 、在紫外灯 (310nm 波长 ) 下观察染色后的凝胶。 DNA 存在处显示出红色的荧光条带 ( 在紫外灯下观察时， 应戴上防护眼镜或有机玻璃防护面罩，避免眼睛遭受 强紫外光损伤，拍照电泳图谱时，可采用凝胶成象系 统 ) 。

23 五. 实验结果报告： 1 、转化效率的计算 ： 转化子总数＝菌落数 × （转化反应原液总体积 / 涂 板菌液体积） 转化效率（每微克质粒 DNA 的转化子数） ＝转化 子总数（个转化子） / 加入质粒 DNA 的量（ μg ） 2 、质粒提取与酶切鉴定结果，贴上打印实验照片 并标明照片上各 DNA 条带的含义。

24 六、思考题： 1 、何谓感受态细胞？制备感受态细胞的理论依据 是什么？ 1 、何谓感受态细胞？制备感受态细胞的理论依据 是什么？ 2 、为什么通常使用 R - M - 菌作为基因工程受体菌？ 2 、为什么通常使用 R - M - 菌作为基因工程受体菌？ 3 、简述 CaCl 2 制备细菌感受态细胞及其转化的基本原 理。 3 、简述 CaCl 2 制备细菌感受态细胞及其转化的基本原 理。 4 、根据 DNA 限制酶的识别切割特性， 催化条件及是 否具有修饰酶活性可分为几种类型？其中 II 类限制性内 切酶有何特性？ 4 、根据 DNA 限制酶的识别切割特性， 催化条件及是 否具有修饰酶活性可分为几种类型？其中 II 类限制性内 切酶有何特性？ 5 、在用碱裂解法小量制备质粒过程中 I 液、 II 液与 III 液 的作用机理是什么？ 5 、在用碱裂解法小量制备质粒过程中 I 液、 II 液与 III 液 的作用机理是什么？ 6 、简述碱裂解法小量制备质粒的原理。 6 、简述碱裂解法小量制备质粒的原理。

25 Thanks ！ Thanks ！