ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΜΟΣ ΚΑΙ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΤΟΥΣ ΚΑΡΚΙΝΙΚΑ ΑΝΤΙΓΟΝΑ: ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΜΟΣ ΚΑΙ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΤΟΥΣ Ράνια Τσιτσιλώνη

LANDMARKS IN TUMOR IMMUNOLOGY 1890: the immune system may responds to cancer: first indications 1950s: Burnet: malignant cells are “self” 1967: immunological “memory” for cancer cells immunoprotection/immune surveillance in mice 1970: athymic nude mice have normal incidence of tumors 1971: human lymphocytes can kill autologous melanoma cells in vitro 1976: Hewitt: spontaneously arising tumors are NOT recognized by the immune system 1985: tumor cells generate immunogenic variants that elicit T cell responses (TAAs) 1991: cloning of the first tumor antigen 1992: Schwartz: tumors lack costims  peripheral T cell tolerance 1995: “licensed” DCs elicit tumor-specific T cell immunity 1995 + …: tumor vaccines; clinical trials 2000 +…: role of innate immune system in tumor immunosurveillance 2003 + …: therapeutic & prophylactic vaccines in the market

Immune Response to Malignant Tumors? Coley’s toxin Bacterial preparation/Vaccine (Streptococcus + Staphylococcus) YES William Coley sarcomas 10% cure rate BCG for bladder cancer? Coley, 1893

LANDMARKS IN TUMOR IMMUNOLOGY 1890: the immune system may responds to cancer: first indications BUT 1950s: Burnet: malignant cells are “self” 1967: immunological “memory” for cancer cells immunoprotection/immune surveillance in mice 1970: athymic nude mice have normal incidence of tumors 1971: human lymphocytes can kill autologous melanoma cells in vitro 1976: Hewitt: spontaneously arising tumors are NOT recognized by the immune system 1985: tumor cells generate immunogenic variants that elicit T cell responses (TAAs) 1991: cloning of the first tumor antigen 1992: Schwartz: tumors lack costims  peripheral T cell tolerance 1995: “licensed” DCs elicit tumor-specific T cell immunity 1995 + …: tumor vaccines; clinical trials 2000 +…: role of innate immune system in tumor immunosurveillance 2003 + …: therapeutic & prophylactic vaccines in the market

LANDMARKS IN TUMOR IMMUNOLOGY 1890: the immune system may responds to cancer: first indications BUT 1950s: Burnet: malignant cells are “self” 1967: immunological “memory” for cancer cells immunoprotection/immune surveillance in mice 1970: athymic nude mice have normal incidence of tumors 1971: human lymphocytes can kill autologous melanoma cells in vitro 1976: Hewitt: spontaneously arising tumors are NOT recognized by the immune system 1985: tumor cells generate immunogenic variants that elicit T cell responses (TAAs) 1991: cloning of the first tumor antigen 1992: Schwartz: tumors lack costims  peripheral T cell tolerance 1995: “licensed” DCs elicit tumor-specific T cell immunity 1995 + …: tumor vaccines; clinical trials 2000 +…: role of innate immune system in tumor immunosurveillance 2003 + …: therapeutic & prophylactic vaccines in the market

Immunological Memory for Tumor Cells IMMUNIZE CHALLENGE OUTCOME KILLED TUMOR CELLS VIABLE TUMOR CELLS control no growth growth YES Mitchison, 1967

LANDMARKS IN TUMOR IMMUNOLOGY 1890: the immune system may responds to cancer: first indications BUT 1950s: Burnet: malignant cells are “self” 1967: immunological “memory” for cancer cells immunoprotection/immune surveillance in mice BUT 1970: athymic nude mice have normal incidence of tumors 1971: human lymphocytes can kill autologous melanoma cells in vitro 1976: Hewitt: spontaneously arising tumors are NOT recognized by the immune system 1985: tumor cells generate immunogenic variants that elicit T cell responses (TAAs) 1991: cloning of the first tumor antigen 1992: Schwartz: tumors lack costims  peripheral T cell tolerance 1995: “licensed” DCs elicit tumor-specific T cell immunity 1995 + …: tumor vaccines; clinical trials 2000 +…: role of innate immune system in tumor immunosurveillance 2003 + …: therapeutic & prophylactic vaccines in the market

LANDMARKS IN TUMOR IMMUNOLOGY 1890: the immune system may responds to cancer: first indications BUT 1950s: Burnet: malignant cells are “self” 1967: immunological “memory” for cancer cells immunoprotection/immune surveillance in mice BUT 1970: athymic nude mice have normal incidence of tumors 1971: human lymphocytes can kill autologous melanoma cells in vitro 1976: Hewitt: spontaneously arising tumors are NOT recognized by the immune system 1985: tumor cells generate immunogenic variants that elicit T cell responses (TAAs) 1991: cloning of the first tumor antigen 1992: Schwartz: tumors lack costims  peripheral T cell tolerance 1995: “licensed” DCs elicit tumor-specific T cell immunity 1995 + …: tumor vaccines; clinical trials 2000 +…: role of innate immune system in tumor immunosurveillance 2003 + …: therapeutic & prophylactic vaccines in the market

Lymphocytes are “Trained” to Kill Tumor Cells tumor cells from melanoma patient lymphocytes from the same melanoma patient MLTC for one week recovered lymphocytes can kill melanoma cells YES recovered lymphocytes can proliferate Parmiani et al, 1971

LANDMARKS IN TUMOR IMMUNOLOGY 1890: the immune system may responds to cancer: first indications BUT 1950s: Burnet: malignant cells are “self” 1967: immunological “memory” for cancer cells immunoprotection/immune surveillance in mice BUT 1970: athymic nude mice have normal incidence of tumors 1971: human lymphocytes can kill autologous melanoma cells in vitro BUT 1976: Hewitt: spontaneously arising tumors are NOT recognized by the immune system 1985: tumor cells generate immunogenic variants that elicit T cell responses (TAAs) 1991: cloning of the first tumor antigen 1992: Schwartz: tumors lack costims  peripheral T cell tolerance 1995: “licensed” DCs elicit tumor-specific T cell immunity 1995 + …: tumor vaccines; clinical trials 2000 +…: role of innate immune system in tumor immunosurveillance 2003 + …: therapeutic & prophylactic vaccines in the market

LANDMARKS IN TUMOR IMMUNOLOGY 1890: the immune system may responds to cancer: first indications BUT 1950s: Burnet: malignant cells are “self” 1967: immunological “memory” for cancer cells immunoprotection/immune surveillance in mice BUT 1970: athymic nude mice have normal incidence of tumors 1971: human lymphocytes can kill autologous melanoma cells in vitro BUT 1976: Hewitt: spontaneously arising tumors are NOT recognized by the immune system 1985: tumor cells generate immunogenic variants that elicit T cell responses (TAAs) 1991: cloning of the first tumor antigen 1992: Schwartz: tumors lack costims  peripheral T cell tolerance 1995: “licensed” DCs elicit tumor-specific T cell immunity 1995 + …: tumor vaccines; clinical trials 2000 +…: role of innate immune system in tumor immunosurveillance 2003 + …: therapeutic & prophylactic vaccines in the market

Malignant Cells are Genetically Unstable YES up to 11,000 genomic alterations! Fenton & Longo, 1995

Το μοντέλο των διαδοχικών γενετικών “χτυπημάτων” στον καρκίνο του εντέρου MCC MSH2 MLH1 PMS1/2 GTBP Fearon, 1992

LANDMARKS IN TUMOR IMMUNOLOGY 1890: the immune system may responds to cancer: first indications BUT 1950s: Burnet: malignant cells are “self” 1967: immunological “memory” for cancer cells immunoprotection/immune surveillance in mice BUT 1970: athymic nude mice have normal incidence of tumors 1971: human lymphocytes can kill autologous melanoma cells in vitro BUT 1976: Hewitt: spontaneously arising tumors are NOT recognized by the immune system 1985: tumor cells generate immunogenic variants that elicit T cell responses (TAAs) 1991: cloning of the first tumor antigen 1992: Schwartz: tumors lack costims  peripheral T cell tolerance 1995: “licensed” DCs elicit tumor-specific T cell immunity 1995 + …: tumor vaccines; clinical trials 2000 +…: role of innate immune system in tumor immunosurveillance 2003 + …: therapeutic & prophylactic vaccines in the market

Κλωνοποίηση του 1ου καρκινικού αντιγόνου 1. Δημιουργία CTL 3. Διαμόλυνση ευκαρυωτικών κυττάρων ή βακτηρίων με καρκινικές cDNA βιβλιοθήκες Τu 3 CTL 3 CTL 1 Τu 1 CTL 2 Τu 2 4. Δοκιμή λύσης από τα CTL YES 2. Screening 5. Κλωνοποίηση Ag με άμεσο πακετάρισμα σε λ-φάγους + λύση CTL ευαίσθητο CTL 1 + 1ο ανθρώπινο καρκινικό Αg = MAGE-1 (μελάνωμα) λύση CTL ευαίσθητο CTL 2 + λύση CTL ευαίσθητο CTL 3 + μη λύση CTL ανθεκτικό CTL 4 Van den Eynde et al, 1991

LANDMARKS IN TUMOR IMMUNOLOGY 1890: the immune system may responds to cancer: first indications BUT 1950s: Burnet: malignant cells are “self” 1967: immunological “memory” for cancer cells immunoprotection/immune surveillance in mice BUT 1970: athymic nude mice have normal incidence of tumors 1971: human lymphocytes can kill autologous melanoma cells in vitro BUT 1976: Hewitt: spontaneously arising tumors are NOT recognized by the immune system 1985: tumor cells generate immunogenic variants that elicit T cell responses (TAAs) 1991: cloning of the first tumor antigen BUT 1992: Schwartz: tumors lack costims  peripheral T cell tolerance 1995: “licensed” DCs elicit tumor-specific T cell immunity 1995 + …: tumor vaccines; clinical trials 2000 +…: role of innate immune system in tumor immunosurveillance 2003 + …: therapeutic & prophylactic vaccines in the market

LANDMARKS IN TUMOR IMMUNOLOGY 1890: the immune system may responds to cancer: first indications BUT 1950s: Burnet: malignant cells are “self” 1967: immunological “memory” for cancer cells immunoprotection/immune surveillance in mice BUT 1970: athymic nude mice have normal incidence of tumors 1971: human lymphocytes can kill autologous melanoma cells in vitro BUT 1976: Hewitt: spontaneously arising tumors are NOT recognized by the immune system 1985: tumor cells generate immunogenic variants that elicit T cell responses (TAAs) 1991: cloning of the first tumor antigen BUT 1992: Schwartz: tumors lack costims  peripheral T cell tolerance 1995: “licensed” DCs elicit tumor-specific T cell immunity 1995 + …: tumor vaccines; clinical trials 2000 +…: role of innate immune system in tumor immunosurveillance 2003 + …: therapeutic & prophylactic vaccines in the market

DCs Elicit Effective Antitumor Responses deLuca & Gommerman, 2012

Τα “αδειοδοτημένα” DCs στον όγκο Μη “αδειοδοτημένο” Terne et al, 2009

Τα “αδειοδοτημένα” DCs στον όγκο Μη “αδειοδοτημένο” “Aδειοδοτημένο” Terne et al, 2009

Τα “αδειοδοτημένα” DCs στον όγκο DCs GFP B16 RFP Hoffman, 2004

LANDMARKS IN TUMOR IMMUNOLOGY 1890: the immune system may responds to cancer: first indications BUT 1950s: Burnet: malignant cells are “self” 1967: immunological “memory” for cancer cells immunoprotection/immune surveillance in mice BUT 1970: athymic nude mice have normal incidence of tumors 1971: human lymphocytes can kill autologous melanoma cells in vitro BUT 1976: Hewitt: spontaneously arising tumors are NOT recognized by the immune system 1985: tumor cells generate immunogenic variants that elicit T cell responses (TAAs) 1991: cloning of the first tumor antigen BUT 1992: Schwartz: tumors lack costims  peripheral T cell tolerance 1995: “licensed” DCs elicit tumor-specific T cell immunity 1995 + …: tumor vaccines; clinical trials 2000 +…: role of innate immune system in tumor immunosurveillance 2003 + …: therapeutic & prophylactic vaccines in the market

The Design of a Clinical Trial Schedule? ….Years?

Η απόδειξη στα ποντίκια… Μάρτυρας Ημέρα 15 Ημέρα 42 Lee et al, 2005

…αλλά και στον άνθρωπο Μεταστατικό μυελοειδές καρκίνωμα του θυρεοειδούς Εβδομάδα 0 Μετά από 13 εβδομάδες ήπαρ πνεύμονες Schott et al, 2005

Νοέμβριος 2005: έγκριση του 1ου κυτταρικού εμβολίου FDA fast-track grant! λευκαφαίρεση απομόνωση APC Ag PAP GM-CSF φόρτωμα APC με Ag Ασθενής Provenge Provenge-ενεργοποιημένο Τ κύτταρο ανενεργό Τ κύτταρο τα ενεργοποιημένα Τ κύτταρα πολλαπλασιάζονται…. …και σκοτώνουν τα προστατικά καρκινικά κύτταρα Small et al, 2005

LANDMARKS IN TUMOR IMMUNOLOGY 1890: the immune system may responds to cancer: first indications BUT 1950s: Burnet: malignant cells are “self” 1967: immunological “memory” for cancer cells immunoprotection/immune surveillance in mice BUT 1970: athymic nude mice have normal incidence of tumors 1971: human lymphocytes can kill autologous melanoma cells in vitro BUT 1976: Hewitt: spontaneously arising tumors are NOT recognized by the immune system 1985: tumor cells generate immunogenic variants that elicit T cell responses (TAAs) 1991: cloning of the first tumor antigen BUT 1992: Schwartz: tumors lack costims  peripheral T cell tolerance 1995: “licensed” DCs elicit tumor-specific T cell immunity 1995 + …: tumor vaccines; clinical trials 2000 +…: role of innate immune system in tumor immunosurveillance 2003 + …: therapeutic & prophylactic vaccines in the market

The Tumor Microenvironment NK cells, NKT cells, Dendritic cells, Macrophages, Eosinophils, Mast cells γδT cells…. Kerkar & Restifo, 2012

LANDMARKS IN TUMOR IMMUNOLOGY 1890: the immune system may responds to cancer: first indications BUT 1950s: Burnet: malignant cells are “self” 1967: immunological “memory” for cancer cells immunoprotection/immune surveillance in mice BUT 1970: athymic nude mice have normal incidence of tumors 1971: human lymphocytes can kill autologous melanoma cells in vitro BUT 1976: Hewitt: spontaneously arising tumors are NOT recognized by the immune system 1985: tumor cells generate immunogenic variants that elicit T cell responses (TAAs) 1991: cloning of the first tumor antigen BUT 1992: Schwartz: tumors lack costims  peripheral T cell tolerance 1995: “licensed” DCs elicit tumor-specific T cell immunity 1995 + …: tumor vaccines; clinical trials 2000 +…: role of innate immune system in tumor immunosurveillance 2003 + …: therapeutic & prophylactic vaccines in the market

Available Cancer Vaccines HPV vaccine (h. cervical cancer) HBV vaccine (liver cancer) mucin I (colon cancer) ? breast cancer? pancreatic cancer? Prophylactic Provenge (prostate cancer) Oncophage (kidney cancer, metastatic melanoma, glioma) OncoVEX (melanoma, head & neck cancer) mAbs (Herceptin, Rituxan, Mylotarg, etc) CimaVax-EGF (lung); Neuvenge (breast, bladder, colon, ovarian); NeuVax (HER/neu tumors); BiovaxID (follicular lymphoma); ADXS31 (renal, colon); SCIB1(melanoma) Therapeutic Finn OJ, 2003

A tumor cell to be immunogenic SHOULD: express MHC class I & class II molecules express increased levels of TSA or TAA express costimulatory signals express adhesion molecules secrete cytokines that differentiate and activate effector cells

Express MHC class I / II molecules Tumor cell MHC class I/II TCR T CELL

Express increased levels of TSA/TAA Tumor cell TCR T CELL

Express costimulatory signals Tumor cell costimulators (CD80, CD86) MHC class I/II CD8/ CD4 T CELL 2 1 CD28 TCR p56lck

Express adhesion molecules Tumor cell costimulators (CD80, CD86) MHC class I/II LFA-3 ICAM-1 CD8/ CD4 T CELL 2 1 CD28 TCR LFA-1 CD2 p56lck

Produce & secrete “good” cytokines Tumor cell costimulators (CD80, CD86) MHC class I/II LFA-3 ICAM-1 IFN-γ IL-4 3 IL-1 IL-6 TNF-α IL-12 IL-15 CD8/ CD4 T CELL 2 1 CD28 TCR LFA-1 CD2 p56lck

Τα χαρακτηριστικά των καρκινικών κυττάρων Αντιστέκονται στον κυτταρικό θάνατο Προωθούν την αγγειογένεση Πολλαπλασιάζονται συνέχεια Είναι αθάνατα Δεν υπακούν στους αναστολείς της ανάπτυξης Ενεργοποιούν τη διήθηση και μετάσταση + αποφεύγουν την καταστροφή από το ανοσοποιητικό σύστημα Hanahan & Weinberg, 2011

Γιατί να ενεργοποιήσουμε το ανοσοποιητικό σύστημα ? γιατί τα κύτταρά του: “ταξιδεύουν” σε όλο το σώμα ενεργοποιούνται από τον καρκίνο δεν είναι τοξικά παρέχουν “συνεχή χημειοθεραπεία” έχουν μνήμη μπορούν να προστατεύσουν από υποτροπές

Tα Τ κύτταρα «βλέπουν» το εσωτερικό του καρκινικού κυττάρου Berzofsky et al, 2004

Human Tumors are Immunogenic because: tumor cells express defined antigens (>500 known) solid tumors have infiltrating lymphocytes tumor-specific T cells and Abs in the periphery of cancer patients some tumors regress spontaneously BUT: most tumor antigens are “self” proteins tumors induce tolerance tumors induce immune suppression (Tregs)

Η φύση των καρκινικών αντιγόνων Tumor specific antigens (TSA), present only on tumor cells encoded by genes specifically expressed by tumors (MAGE) encoded by variant forms of normal genes altered by mutations (β-catenin) b. Tumor associated antigens (TAA), present on tumor cells and some normal cells normally expressed at certain differentiation stages or lineages (tyrosinase, Melan-A/MART-1) mutated proteins (k-ras, p53) overexpressed proteins (HER-2/neu)

Μηχανισμοί δημιουργίας καρκινικών αντιγόνων (or specific gene expression) (or expression of mutated protein)

Καρκινικά Ags (πεπτίδια ή πρωτεΐνες) Ογκοεμβρυϊκές πρωτεΐνες (CEA, α-FP) Ογκοπρωτεΐνες (p53, HER2, ras) Ογκοϊικές πρωτεΐνες (HBV, EBV, HPV) Γλυκοσυλιωμένες πρωτεΐνες (muc1) Μεταλλαγμένες πρωτεΐνες (BRCA1/2) Περιορισμένες σε ιστό (PSA, Melan-A/MART-1) Εκχυλίσματα καρκινικών κυττάρων Τμήματα DNA με επιθυμητό γονίδιο

Μέθοδοι ταυτοποίησης Γενετική προσέγγιση Βιοχημική προσέγγιση Αντίστροφη ανοσολογία (reverse immunology) Ορολογική προσέγγιση (SEREX) Χρησιμοποίηση διαγονιδιακών ποντικών

Γενετική προσέγγιση (Ι) Δημιουργία CTL σειρών έναντι αυτόλογων καρκινικών κυττάρων Οι CTL σειρές εμπεριέχουν πολλούς CTL κλώνους που αναγνωρίζουν ΤΑΑ πάνω στους κλώνους των καρκινικών κυττάρων Τu 1 CTL 1 CTL 3 Τu 3 CTL 2 Τu 2

Γενετική προσέγγιση (ΙΙ) Κλωνοποίηση καρκινικών και έλεγχος λύσης τους από τις αυτόλογες CTL σειρές. Οι καρκινικοί κλώνοι που είναι αρνητικοί για το ΤΑΑ δεν αναγνωρίζονται και επιβιώνουν. + Λύση CTL ευαίσθητος CTL 1 + Λύση CTL ευαίσθητος CTL 2 + Λύση CTL ευαίσθητος CTL 3 + Όχι λύση CTL ανθεκτικός CTL 4

Γενετική προσέγγιση (ΙΙΙ) Δημιουργία γενομικών ή cDNA βιβλιοθηκών από τους CTL ευαίσθητους καρκινικούς κλώνους Διαμόλυνση CTL ανθεκτικών καρκινικών κυττάρων (αυτόλογων ή που να εκφράζουν το κατάλληλο ΜΗC αλληλόμορφο) με το cDNA Χαρακτηρισμός των διαμολυνθέντων κυττάρων που εκφράζουν το ΤΑΑ βασιζόμενοι στην ικανότητα τους να λύονται από το ανάλογο ογκοειδικό CTL Απομόνωση του γονιδίου που κωδικοποιεί για το ΤΑΑ με άμεσο πακετάρισμα σε λ-φάγους

Βιοχημική προσέγγιση (Ι) Δημιουργία CTL σειρών έναντι αυτόλογων καρκινικών κυττάρων MHC molecule Τumor cell CTL Antigenic peptide Εκχύλιση των πεπτιδίων που βρίσκονται στις σχισμοειδείς θήκες των MHC μορίων.

Βιοχημική προσέγγιση (ΙΙ) Διαχωρισμός των πεπτιδίων με HPLC και συλλογή των επιμέρους κλασμάτων. Φόρτωμα του κάθε πεπτιδικού κλάσματος σε κύτταρα-στόχους που φέρουν πανομοιότυπα MHC αλληλόμορφα (πχ Τ2) και έλεγχος λύσης τους από τα ογκοειδικά CTL. CTL CTL CTL CTL

Βιοχημική προσέγγιση (ΙΙΙ) Ταυτοποίηση του πεπτιδίου με δεύτερο διαχωρισμό σε αναλυτικότερο HPLC, αποικοδόμηση κατά Edman και φασματοσκοπία μάζας (tandem mass spectrometry). TAA peptide 1 TAA peptide 3 TAA peptide 2 TAA peptide 4

Αντίστροφη ανοσολογία (Ι) Σύνθεση πεπτιδίων από την αλληλουχία μιας ογκοειδικής πρωτεΐνης (πχ. HER2/neu) βασιζόμενοι στην παρουσία συγκεκριμένων αμινοξικών καταλοίπων (anchor motifs) για ένα ορισμένο αλληλόμορφο (πχ HLA-A2). Βάσεις για πρόβλεψη πεπτιδίων μέσω αλγορίθμων: http://bimas.dcrt.nih.gov:80/molbio/hla_bind http://www.uni-tuebingen.de/uni/kxi/SYFPEITHI

anchors or auxiliary anchors HLA-A2 HLA-DR4 1 2 1 3 2 4 8 9 7 3 4 9 5 6 5 6 7 8 Position 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Position 1 2 3 4 5 6 7 8 9 anchors or auxiliary anchors L V V M L preferred residues E K other residues I A G I I A E L Y P K L Y S F F D Y T H K P T N M M G Y S F V R V H anchors or auxiliary anchors F W I L V M P W I L V A D E N S T Q H R D E H K N Q R S T Y A C I L M V D E H K N Q R S T Y A C I L M V

Αντίστροφη ανοσολογία (ΙΙ) Έλεγχος συγγένειας πρόσδεσης σε MHC (συγκέντρωση πεπτιδίου που αναστέλλει το 50 % της πρόσδεσης γνωστού πεπτιδίου MHC-προσδέτη) + + 100 % πρόσδεση ΜΗC β2-μικροσφ MHC-προσδέτης + + + + 50 % πρόσδεση νέο πεπτίδιο Ικανότητα πεπτιδίου να επάγει CTL (δημιουργία CTL ικανών να λύουν κύτταρα-στόχους [Τ2] φορτωμένα με το πεπτίδιο) + Λύση T2 CTL

Αντίστροφη ανοσολογία (ΙΙΙ) Έκφραση του πεπτιδίου και σε καρκινικά κύτταρα τα οποία να λύονται από τα CTL εφόσον εκφράζουν την πατρική ογκοπρωτεΐνη (ο επίτοπος να είναι και naturally processed) + Λύση T2 CTL + Λύση Tu CTL επεξεργασία του αντιγόνου Tu

Ορολογική προσέγγιση (Ι) SEREX: serological analysis of the autologous tumor antigens by recombinant cDNA expression Δημιουργία cDNA βιβλιοθήκης από φρέσκα καρκινικά δείγματα (πχ. χειρουργικά αφαιρεθέντες όγκοι ή καρκινικά κύτταρα από ασκιτικά και πλευριτικά υγρά) Η βιβλιοθήκη κλωνοποιείται σε λ-φάγο Οι ανασυνδυασμένοι φάγοι μεταφέρουν το DNA σε βακτήρια E. coli (λυτική μόλυνση) Μεταφορά ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης Ανίχνευση αντιδραστικότητάς τους με IgG αντισώματα που υπάρχουν στον ορό του ασθενούς (χρήση αραιωμένου ορού του ασθενούς) Προσδιορισμός της αλληλουχίας νουκλεοτιδίων από το εισαχθέν cDNA.

Ορολογική προσέγγιση (II)

Ορολογική προσέγγιση (IIΙa) Πλεονεκτήματα της μεθόδου SEREX Χρησιμοποίηση κυττάρων από τον όγκο: δεν χρειάζεται καλλιέργεια καρκινικών κυττάρων in vitro, μείωση artifacts λόγω μακρόχρονης καλλιέργειας (πχ. έκφραση νέων αντιγόνων από τα καρκινικά) Εντοπισμός αντιγόνων που προκαλούν ισχυρή ανοσοαπόκριση στον καρκινοπαθή (ο ορός του ασθενή αραιώνεται 1:100-1:1000 και άρα οδηγεί στον εντοπισμό IgG ανοσοσφαιρινών που βρίσκονται σε υψηλό τίτλο στον ορό, άρα επάγεται υψηλού βαθμού ενεργοποίηση των Τh κυττάρων) Με τη χρησιμοποίηση cDNA βιβλιοθηκών η ανάλυση δεν περιορίζεται σε επιφανειακά αντιγόνα, αλλά καλύπτει το σύνολο των πρωτεϊνών που εκφράζονται από τα γονίδια του όγκου Επιτρέπει τον απευθείας μοριακό προσδιορισμό των αντιγόνων αφού η αλληλουχία του cDNA των αντιγόνων του όγκου μπορεί να προσδιοριστεί άμεσα Η έκφραση του αντιγόνου σε φυσιολογικό ιστό μπορεί να προσδιοριστεί με ανάλυση της έκφρασης του mRNA με Nothern Blot και Reverse Transcription-PCR, χωρίς να χρειάζεται η καλλιέργεια κυττάρων που μπορεί να οδηγήσει σε artifacts

Ορολογική προσέγγιση (IΙIb) Προβλήματα της μεθόδου SEREX Ψευδώς θετικά αποτελέσματα: προέρχονται από την έκφραση γονιδίων ανοσοσφαιρινών στα βακτήρια λόγω της ύπαρξης λεμφοκυττάρων ανάμεσα στα κύτταρα του όγκου κατά την κατασκευή της cDNA βιβλιοθήκης. Δεν μπορεί να ανιχνευτεί όλο το φάσμα των καρκινικών αντιγόνων (πχ. γλυκοσυλιωμένα αντιγόνα ή αντιγόνα που υπόκεινται σε μετατροπές κατά την έκφρασή τους σε βακτήρια) Χάνονται αντιγόνα που δεν έχουν προλάβει να προκαλέσουν ανοσολογική απόκριση από τον οργανισμό κατά τη στιγμή της χειρουργικής αφαίρεσης του όγκου

Χρήση διαγονιδιακών ζώων (Ι) Σύνθεση πεπτιδίων με επικαλυπτόμενες αλληλουχίες από μια ανθρώπινη ογκοειδική ή ογκοσχετιζόμενη πρωτεΐνη 1 40 πατρική πρωτεΐνη 1-10 5-15 10-20 15-25 20-30 25-35 30-40

Χρήση διαγονιδιακών ζώων (ΙΙ) Ανοσοποίηση διαγονιδιακών ποντικών που εκφράζουν συγκεκριμένο HLA αλληλόμορφο με την ανασυνδυασμένη πατρική ογκοπρωτεΐνη HLA-A2 HLA-B27 ογκοπρωτεΐνη ογκοπρωτεΐνη Τ λεμφοκύτταρα που αναγνωρίζουν HLA-A2-περιοριζόμενα πεπτίδια από την ογκοπρωτεΐνη Τ λεμφοκύτταρα που αναγνωρίζουν HLA-B27-περιοριζόμενα πεπτίδια από την ογκοπρωτεΐνη

Χρήση διαγονιδιακών ζώων (ΙΙΙ) Δοκιμασία παραγωγής IFN-γ από Τ λεμφοκυττάρων των ποντικών όταν ενεργοποιηθούν με τα συνθετικά πεπτίδια (ELISA ή ELISPOT) ELISA ELISPOT +/ve -/ve -/ve +/ve +/ve

Peptide Vaccination size of peptides: SLPs ? vaccination schedule: ? naked CTL +/- helper epitopes combined with cytokines (IL-2, IL-12) with adjuvants (GM-CSF, TLR/CD40 agonists?) longer peptides (naturally flanking sequences) modified peptides (lipid tails?) size of peptides: SLPs ? vaccination schedule: ? dose: ? routes of injection: id, sc, it ?

The Hallmarks of Peptide Vaccination (7) (6) (1) (5) (2) (4) (3) SOS!!! van Hall & van der Burg, 2012

Τα στοιχεία των σύγχρονων πεπτιδικών αντικαρκινικών εμβολίων Ca αντιγόνο όχημα ανοσοενιχυτικό 

Reactivity in vitro (%) to Clinical objective responses (%) Τροποποιήσεις συνθετικών πεπτιδίων (κλινική δοκιμή με επίτοπο της gp100 σε ασθενείς με μελάνωμα) gp100209-217 : 1 2 3 4 5 6 7 8 9 I T D Q V P F S V wild type I M D Q V P F S V modified gp100209-217(M) vs. gp100209-217(wt) : in vitro studies: 9-fold better binding to HLA-A*201 higher levels of IFN-γ and GM-CSF production by gp100209-217(M) –specific T cell clones Clinical studies (melanoma patients) Vaccination Reactivity in vitro (%) to Clinical objective responses (%)   gp100(wt) gp100(M) gp100(wt) +IFA+IL-2 20 25 10 gp100(M) +IFA+IL-2 80 90 42

Ανάλογα πεπτιδίων (CEA) με αυξημένη συγγένεια για δέσμευση στον TCR Y L S G A N L N L wild type Y L S G A D L N L peptide analog (610D) Biological properties CEA605-613 CEA605-613(610D) MHC class I binding ++ ++ Lysis of indicator cells 10-2 μM 10-4 μM TAP-70 phosphorylation + ++ GM-CSF production (3ng/mL) 0,002μg/mL 0,2 μg/mL IFN-γ production (2ng/mL) 0,002 μg/mL 0,2μg/mL

GARDASIL: From Bench Top to Bed-side Vaccine charasteristics non-infectious recombinant (yeast) quadrivalent (capsid prt of HPV types 6, 11, 16, 18) approved for women aged 9-26 years prevention of cervical cancer & genital wards, vulvar and vaginal precancerous lesions Clinical trials Phase I : 2,391 women, efficacy 100 % over 40 months Phase II : 552 women, efficacy 100 % over 5 years Phase III : 18,000 women, efficacy 100 % over 2 years

Τα στοιχεία των σύγχρονων πεπτιδικών αντικαρκινικών εμβολίων Ca αντιγόνο όχημα ανοσοενιχυτικό  

To Optimize Vaccine Delivery… DEFINED TUMOR ANTIGENS DCs as vehicles ? WHOLE TUMOR CELL LYSATES (TUMOR EXTRACTS)

Because Cancer Cells are “smart”…

BUT…mature DCs can be “smarter” ! Fujii et al., 2009

Παρασκευή δενδριτικών κυττάρων in vitro “Φόρτωμα” με αντιγόνα Ώριμα DCs Επανέγχυση TNF-α ώρες 1-2 ημέρες Ανώριμα DCs Επιλογή μονοκυττάρων 5-6 ημέρες GM-CSF IL-4 ώρες PBMC (λευκαφαίρεση)

CEA-pulsed DCs used for vaccination of CEA+ tumor patients General Protocol day –10: FLT3 days 0 and 28: Leucapheresis days 7 and 33: DC vaccination day 58 and on: Follow-up   CTL-PRE CTL-POST CEA+-CTL-PRE CEA+-CTL-POST CEA+-CTL FOLD EXPANSION CR (n=4) 3-5 % 26-38 % 0,28-0,40 % 1,03-1,15 % 2,6-3,7 PD (n=7) 3-12 % 0-43 % 0,03-0,26 % 0,04-0,50 % 0-1,1 SD (n=2) 5-8 % 33-41 % 0,15-0,43 % 1,05-1,11 % 2,4-7,4

Σύντηξη δενδριτικών με καρκινικά κύτταρα (DC/Tu Hubrids) PEG ή ηλεκτροσύντηξη Avigan et al., 2012

Τα στοιχεία των σύγχρονων πεπτιδικών αντικαρκινικών εμβολίων Ca αντιγόνο όχημα ανοσοενιχυτικό  ? 

Υποδοχείς Toll: από τη δροσόφιλα στον άνθρωπο Christiane Nüsslein-Volhard Νόμπελ Φυσιολογίας 1995 Anderson et al, 1985

Ο υποδοχέας τύπου Toll 4 αναγνωρίζει τον LPS των Gram - βακτηρίων Ψευδομονάδα Klebsiella Salmonella Escherichia coli Neisseria

Μετά από 100 χρόνια, ο Coley είχε δίκιο ! Βακτηριακό παρασκεύασμα/Εμβόλιο (Streptococcus + Staphylococcus) William Coley σαρκώματα 10% θεραπεία Coley, 1893

Τι κάνουν τα ανοσοενισχυτικά ? Ο στόχος είναι να αυξήσουν την ανοσογονικότητα των αντιγόνων Οι μηχανισμοί δράσης τους ελάχιστα κατανοητοί Δεν υπάρχουν πρότυπες δοκιμασίες για να καθοριστεί η ανοσοενίσχυση (adjuvanticity). Συνήθως μετρούμε τις ανοσολογικές ή κλινικές απαντήσεις Δρουν ανάλογα με τη φύση του αντιγόνου, χυμικές vs κυτταροτοξικές απαντήσεις Coukos et al., 2011

Ανοσοενισχυτικά/Ανοσοτροποποιητικά μόρια (Adjuvants) Εξειδικευμένοι ανοσοτροποποιητές Κυτταροκίνες (GM-CSF, IL-2, IFN-α, κ.α.) CD40-συνδέτης , αντι-CD40 Αb Μη εξειδικευμένοι ανοσοτροποποιητές IFA, Montanide ISA 51 και 720 (γαλακτώματα νερού –λαδιού) Άλατα αλουμινίου (alum) Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH) Ανοσοενισχυτές Συνδέτες των υποδοχέων τύπου Toll (TLR), NOD, κ.α. λιποπολυσακχαρίτες (LPS, MPLA), λιποπεπτίδια (MALP-2) πεπτιδογλυκάνες dsRNA (Poly I:C), ολιγο-δεοξυνουκλεοτίδια (CpG), ανάλογα DNA, RNA (imiquimod) μυκοβακτηριδιακά στελέχη (BCG) Προθυμοσίνη α (προΤα)

Η απόδειξη στα ποντίκια…. Imiquimod = αγωνιστής του TLR-7 Μάρτυρας αιμαγγειο- ενδοθηλίωμα Ημέρα 9 Ημέρα 17 Sidbury et al, 2003

…αλλά και στον άνθρωπο 6 εβδομάδες μετά Βασικοκυτταρικά Ca 12 εβδομάδες μετά Tandon & Brodell, 2012

Κλινικές δοκιμές με αγωνιστές των TLR BCG (TLR-2, -4, -1/6): Ca ουροδόχου, μαστού, πνεύμονα, εντέρου, ωοθηκών MPLA (TLR-4): NSC πνεύμονα, μεταστατικό μελάνωμα, μαστός, κεφαλής και τραχήλου CpG ολιγονουκλεοτίδια (TLR-9): μελάνωμα, γλοιοβλάστωμα, σάρκωμα,μεταστατικό μαστού Poly-I:C (TLR-3): προστάτη, μελάνωμα, ωοθηκών Imiquimod (TLR-7): μελάνωμα, προστάτη, ΧΛΛ, εγκεφάλου, νευροβλάστωμα

Οι TLRs ενεργοποιούνται και από DAMPs Matzinger, 2000; Brennan et al, 2010

2013: ο ανοσογονικός τύπου θανάτου χημειοθεραπεία ή/και ακτινοθεραπεία Ca κύτταρα που πεθαίνουν Ενεργοποίηση και ωρίμανση δενδριτικών κυττάρων Παρουσίαση Ca αντιγόνων στα Τ κύτταρα ογκοειδικά Τ κύτταρα  καρκινικό Δενδριτικό κύτταρο HSP, προΤα, +++ Kono & Mimura, 2013

Human Tumors are Immunogenic because: tumor cells express defined antigens (>500 known) solid tumors have infiltrating lymphocytes tumor-specific T cells and Abs in the periphery of cancer patients some tumors regress spontaneously BUT: most tumor antigens are “self” proteins tumors induce tolerance tumors induce immune suppression (Tregs)

Τρόποι διαφυγής των καρκινικών κυττάρων από την ανοσοεπιτήρηση

Frequency of HLA class I antigen loss or down-regulation in various human cancers

Frequency of TAP loss or down-regulation in various human cancers

Σύνοψη των μηχανισμών διαφυγής καρκινικών κυττάρων από την ανοσοεπιτήρηση Failure to express MHC antigen Abnormal expression of adhesion or accessory molecules Induction of suppressor (regulatory) cells Occurence in immuno suppressed hosts Changes in T cell signal transduction molecules Decrease of and heterogeneity of TAA expression Anergy induction or clonal deletion of responding cells Utilization of products of tumor- stimulated leukocytes for tumor cell growth Secretion of immune -downregulatory soluble factors Inhibition of NK-activity by the absence of activating ligands and/or presence of inhibitory receptors