Βιοσύνθεση και αποδόμηση των νουκλεοτιδίων Παπαπαναγιώτου Αγγελική

Νουκλεοτίδια: Ουσίες που εκπληρώνουν βασικές λειτουργίες μέσα στα κύτταρα : Βασικές μονάδες των νουκλεïκών οξέων (DNA, RNA) Αντιγραφή, Μεταγραφή Συμμετέχουν σε πολλές βιοχημικές αντιδράσεις του μεταβολισμού ATP (κεντρικό ρόλο στις ανταλλαγές ενέργειας) UDP-γλυκόζη (παράγωγο των νουκλεοτιδίων) – ενεργοποιημένη ενδιάμεση ένωση στην βιοσύνθεση του γλυκογόνου Νουκλεοτίδια περιέχονται στα μόρια των συνενζύμων CoA, NAD+, FAD cAMP,cGMP – συμμετέχουν στην ενδοκυττάρια μετάδοση διαφόρων εξωκυττάριων μηνυμάτων σαν δεύτεροι αγγελιοφόροι

Νουκλεοζίδια ή νουκλεοζίτες : Νουκλεοτίδια: Φωσφορικοί εστέρες των νουκλεοζιδίων Νουκλεοζίδια ή νουκλεοζίτες : Ετεροκυκλική Βάση +(Ν-γλυκοζιτικό δεσμό) Σάκχαρο (ριβόζη ή δεοξυριβόζη)

Αζωτούχες βάσεις Πυριμιδίνες Πουρίνες Κυτοσίνη (DNA, RNA)

Αζωτούχες βάσεις Δακτύλιος των πυριμιδινών Δακτύλιος των πουρινών

Βάσεις πυριμιδίνης Βάσεις πουρίνης Κυτοσίνη (2-οξυ-4-άμινο- Πυριμιδίνη) Ουρακίλη (2-οξυ-4-οξυ- Πυριμιδίνη) Αδενίνη (2-οξυ-4-άμινο- Πυριμιδίνη) Γουανίνη (2-αμινο-6-οξυ- Πυριμιδίνη) Θυμίνη (2-οξυ-4-οξυ-5-μεθυλο- Πυριμιδίνη)

Νουκλεοζίδια (βάση + σάκχαρο) Κυτιδίνη Ουριδίνη Αδενοσίνη Υποξανθίνη Γουανοσίνη Ινοσίνη

Nουκλεοτίδια παράγονται: De novo οδούς: αμινοξέα, 5-φωσφορική ριβόζη, CO2, NH3 Οδούς διάσωσης: ανακυκλώνουν τις ελεύθερες βάσεις και τα νουκλεοτίδια που απελευθερώνονται από την αποδόμηση των νουκλεϊνικών οξέων

Βιοσύνθεση νουκλεοτιδίων: Οι περισσότεροι οργανισμοί συνθέτουν νουκλεοτίδια πουρινών και πυριμιδινών de novo ή με αντιδράσεις περίσωσης. Τα νουκλεοτίδια αποτελούν τμήματα του μορίου των νουκλεικών οξέων ( ριβονουκλεοτίδια  RNA, δεοξυριβονουκλεοτίδια  DNA) - Κύτταρα τα οποία έχουν μικρό χρόνο διπλασιασμού χρειάζονται και μεγάλη ποσότητα RNA και DNA και επομένως μεγάλα ποσά νουκλεοτιδίων Τα μονοπάτια βιοσύνθεσης των νουκλεοτιδίων αποτελούν ελκυστικό στόχο φαρμάκων κατά του καρκίνου και κατά διαφόρων λοιμογόνων μικροοργανισμών Πολλά αντιβιοτικά και αντικαρκινικά φάρμακα αποτελούν αναστολείς της βιοσύνθεσης των νουκλεοτιδίων

Οι de novo οδοί βιοσύνθεσης των πουρινών και πυριμιδινών φαίνονται σχεδόν ταυτόσημες σε όλους τους ζωντανούς οργανισμούς. Οι ελεύθερες βάσεις γουανίνη, αδενίνη, θυμίνη, κυτοσίνη, ουρακίλη δεν είναι ενδιάμεσα σε αυτές τις οδούς.

- Αποσαφηνίστηκε με την χρήση ισοτόπων σε βιοσυνθετικά πειράματα. Βιοσύνθεση πουρινών - Αποσαφηνίστηκε με την χρήση ισοτόπων σε βιοσυνθετικά πειράματα. - Τα εννέα άτομα του δακτυλίου προέρχονται από: N1 ασπαρτικό οξύ N3, N9 γλουταμίνη C4, C5, N7 γλυκίνη C6 CO2 C2, C8 συνένζυμα του τετραυδροφυλλικού Η σύνθεση του δακτυλίου ξεκινά από την 5-φωσφορική ριβόζη του νουκλεοτιδίου (R-5-P) Το πλαίσιο για μια βάση πουρίνης συντίθεται τμηματικά κατ’ ευθείαν επάνω σε μια δομή που βασίζεται στη ριβόζη

Η μεταβολική προέλευση των 9 ατόμων του δακτυλίου των πουρινών Γλυκίνη Ασπαρτικό οξύ THFA THFA Γλουταμίνη (αμιδικό άζωτο)

Το ΙΜΡ (ινοσινικό) είναι η βάση για τη σύνθεση όλων των πουρινικών νουκλεοτιδίων.

Ο δακτύλιος πουρίνης δομείται σταδιακά και ταυτόχρονα συνδέεται με τη ριβόζη. Ο δακτύλιος πουριμιδίνης δομείται ως οροτικό, συνδέεται με τη φωσφορική ριβόζη και έπειτα μετατρέπεται στα κοινά νουκλεοτίδια πυριμιδίνης

Σημαντικός πρόδρομος και στις δύο οδούς είναι η πυροφωσφορική φωσφοριβόζη ( PRPP).

Ενα αμινοξύ είναι σημαντικός πρόδρομος σε κάθε τύπο οδού: η γλυκίνη για τις πουρίνες και το ασπαρτικό για τις πυριμιδίνες.

Στη de novo σύνθεση των πουρινών όλα τα ένζυμα βρίσκονται στο κύτταρο υπό μορφή μεγάλων πολυενζυμικών συμπλόκων.

Μ΄ εξαίρεση το ΑΤΡ, τα αποθέματα των νουκλεοτιδίων στο κύτταρο είναι πολύ μικρά. Συνεπώς τα κύτταρα πρέπει να συνεχίζουν να συνθέτουν νουκλεοτίδια κατά τη διάρκεια της σύνθεσης των νουκλεϊνικών οξέων και μερικές φορές, η σύνθεση των νουκλεοτιδίων ίσως περιορίζει την ταχύτητα της αντιγραφής και της μεταγραφής του DNA. Παράγοντες που αναστέλλουν τη σύνθεση των νουκλεοτιδίων είναι πολύ σημαντικά φάρμακα της σύγχρονης ιατρικής

De novo βιοσύνθεση νουκλεοτιδίων πουρίνης Τα δύο “πατρικά” νουκλεοτίδια πουρίνης των νουκλεϊνικών οξέων είναι η 5΄-μονοφωσφορική αδενοσίνη (ΑΜΡ, αδενυλικό) και η 5΄-μονοφωσφορική γουανοσίνη (GMP, γουανυλικό), που περιέχουν τις βάσεις πουρίνης.

De novo βιοσύνθεση νουκλεοτιδίων πουρίνης

5-φωσφοριβοσυλο-1-πυροφωσφορικό (PRPP) ΙΝΟΣΙΝΙΚΟ ΟΞΥ (ΙΜΡ) πυροφωσφοκινάση της 5-Ρ-ριβόζης 5-φωσφορική ριβόζη του νουκλεοτιδίου 5-φωσφοριβοσυλο-1-πυροφωσφορικό (PRPP) PRPP-γλουταμυλ- αμινοτρανφεράση 5-φωσφοριβοσυλαμίνη

Βιοσύνθεση ΑΜP και GMP από IMP

Ρυθμιστικοί μηχανισμοί στη βιοσύνθεση των νουκλεοτιδίων αδενίνης και γουανίνης

Βιοσύνθεση των πυριμιδινών Σε αντίθεση με τις πουρίνες, οι πυριμιδίνες δεν συντίθενται σαν νουκλεοτίδια Προηγείται η σύνθεση του δακτυλίου και ακολουθεί η προσθήκη της 5-φωσφορικής ριβόζης Το φωσφορικό καρβαμύλιο και το ασπαρτικό είναι τα πρόδρομα μόρια από τα οποία θα σχηματιστεί ο δακτύλιος των πυριμιδινών

Τα νουκλεοτίδια πυριμιδίνης παρασκευάζονται από ασπαρτικό, PRPP, και φωσφορικό καρβαμύλιο Τα κοινά ριβονουκλεοτίδια πυριμιδίνης είναι η 5΄-μονοφωσφορική κυτιδίνη (CMP, κυτιδυλικό) και η 5΄-μονοφωσφορική ουριδίνη (UMP,ουριδυλικό), τα οποία περιέχουν αντιστοίχως, τις πυριμιδίνες κυτοσίνη και ουρακίλη. Πρώτα δημιουργείται ο εξαμελής δακτύλιος πυριμιδίνης και στη συνέχεια συνδέεται με την 5΄φωσφορική ριβόζη Το φωσφορικό καρβαμύλιο που απαιτείται για την βιοσύνθεση των πυριμιδινών παράγεται στο κυτταρόπλασμα από την συνθετάση ΙΙ.

Η προέλευση των 6 ατόμων του δακτυλίου των πυριμιδινών Φωσφορικό Καρβαμύλιο (όξινο ανθρακικό + γλουταμίνη) Ασπαρτικο

Βιοσυνθετική οδός των πυριμιδινών γλουταμίνη φωσφορικό καρβαμύλιο Ν-καρβαμυλοασπαρτικό ουριδιλικό οξύ UMP διυδροοροτάση αποκαρβοξυλάση του οροτιδυλικού οξέος οροτική φωσφολιβοσυλο τρανσφεράση αφυδρογονάση του DHO οροτικό οξύ διυδοοροτικό οξύ (DHO) οροτιδιλικό οξύ ATCase : Ασπαρτική τρανσκαρβαμυλάση CPS II : Συνθετάση του φωσφορικού καρβαμυλίου

Βακτηριακή συνθετάση του φωσφορικού καρβαμυλίου

De novo βιοσύνθεση νουκλεοτιδίων πυριμιδίνης

Έλεγχος της σύνθεσης των πυριμιδινών Ασπαρτική τρανσκαρβαμυλάση

Η βιοσύνθεση των νουκλεοτιδίων πυριμιδίνης ρυθμίζεται με ανάδρομη αναστολή Η βακτηριακή ATCάση αποτελείται από έξι καταλυτικές και έξι ρυθμιστικές υπομονάδες. Οι καταλυτικές υπομονάδες προσδένουν τα υποστρώματα, ενώ οι αλλοστερικές υπομονάδες προσδένουν τον αλλοστερικό αναστολέα. Το μόριο της ΑΤCασης έχει την ενεργό και την ανενεργό διαμόρφωση. Το ένζυμο εμφανίζει μέγιστη ενεργότητα όταν το CTP δεν είναι συνδεδεμένο στις ρυθμιστικές υπομονάδες. Όταν συσσωρευτεί CTP, οι ρυθμιστικές υπομονάδες υφίστανται αλλαγή διαμόρφωσης, η οποία μεταδίδεται στις καταλυτικές υπομονάδες που μεταπίπτουν σε ανενεργό διαμόρφωση. Το ΑΤΡ παρεμποδίζει τις αλλαγές που επάγονται από το CTP.

Αλλοστερική ρύθμιση της τρανσκαρβαμυλάσης του ασπαρτικού τό το CTP και ATP

Τα μονοφωσφορικά νουκλεοτίδια μετατρέπονται σε τριφωσφορικά Τα νουκλεοτίδια που πρόκειται να χρησιμοποιηθούν σε συνθέσεις μετατρέπονται σε τριφωσφορικά νουκλεοσίδια. Οι οδοί της μετατροπής είναι ίδιες σε όλα τα κύτταρα. Η φωσφορυλίωση του AMP σε ADP προάγεται από την κινάση του αδενυλικού. ΑΤΡ + ΑΜΡ 2ΑDP 

To ATP μπορεί να μεσολαβεί στο σχηματισμό των άλλων διφωσφορικών ενζύμων με την δράση των κινασών των μονοφωσφορικών νουκλεοσιδίων ΑΤΡ+ΝΜΡ ADP+NDP  Τα διφωσφορικά νουκλεοσίδια μετατρέπονται σε τριφωσφορικά με τη δράση της κινάσης των διφωσφορκών νουκλεοσιδίων NTPD+NDPANDPD+NTPA

Τα ριβονουκλεοτίδια είναι οι πρόδρομοι των δεοξυριβονουκλεοτιδίων Τα δεοξυριβονουκλεοτίδια προέρχονται από τα’ αντίστοιχα ριβονουκλεοτίδια με άμεση αναγωγή στο 2΄-άτομο άνθρακα της D-ριβόζης. ΑDP dADP GDPdGDP Καταλύεται από την αναγωγάση των ριβονουκλεοτιδίων

Αναγωγή ριβονουκλεοτιδίων σε δεοξυριβονουκλεοτίδια από την αναγωγάση των ριβονουκλεοτιδίων

Μεταφορά ηλεκτρονίων από το NADPH στην αναγωγάση των διφωσφορικών ριβονουκλεοσιδίων Αναγωγάση της θειορεδοξίνης Αναγωγάση των διφωσφορικών ριβονουκλεοσιδίων Θειορεδοξίνη

Αναγωγάση των ριβονουκλεοτιδίων

Οι υπομονάδες R2 της αναγωγάσης των ριβονουκλεοτιδίων

Πιθανώς μηχανισμός για την αντίδραση της αναγωγάσης των ριβονουκλεοτιδίων

. Η ειδικότητα και ενεργότητα της αναγωγάσης των ριβονουκλεοτιδίων στο Ε.coli ρυθμίζονται από την πρόσδεση μορίων τελεστών. Κάθε R1 έχει δύο είδη ρυθμιστικών θέσεων. Οι θέσεις του πρώτου είδους επηρεάζουν την συνολική ενεργότητα του ενζύμου και προσδένουν είτε ATP( ενεργοποιεί το ένζυμο), είτε dATP (απενεργοποιεί). Οι θέσεις του δεύτερου είδους τροποποιούν την ειδικότητα ως προς το υπόστρωμα σε απάντηση προς το μόριο-τελεστή που προσδένουν (ATP, dATP, dTTP, dGTP)

Oταν προσδένουν ΑΤΡ ή dATP ευνοείται η αναγωγή των UDP και CDP, ενώ όταν προσδένουν dTTP ή dGTP διεγείρεται η αναγωγή του GDP ή του ADP. Αυτή η ρύθμιση εξασφαλίζει μια ισορροπημένη δεξαμενή πρόδρoμων μορίων για σύνθεση του DNA Το ΑΤΡ επίσης δρα ως γενικός ενεργοποιητής τόσο για τη βιοσύνθεση όσο και για ην αναγωγή των ριβονουκλεοτιδίων

Ρύθμιση της αναγωγάσης των ριβονουκλεοτιδίων από τριφωσφορικά δεοξυνουκλεοτίδια

To DNA περιέχει θυμίνη αντί για ουρακίλη και η de novo οδός του θυμιδιλικού περιλαμβάνει μόνο δεοξυριβονουκλεοτίδια.

Βιοσύνθεση του θυμιδιλικού

Η μετατροπή του dUTP πρέπει να είναι αποτελεσματική ώστε να διατηρεί τ’ αποθέματα του dUTP χαμηλά και ν’ αποτρέπει την ενσωμάτωση του ουριδυλικού στο DNA.

Σύνθεση θυμιδυλικού (TMP) από dUMP

Αποδόμηση των πουρινών Ο καταβολισμός των πουρινών οδηγεί σε ουρικό οξύ (άνθρωπο, πτηνά, έντομα, ερπετά) Νουκλεικά οξέα νουκλεάσες Νουκλεοτίδια Νουκλεοτίδια νουκλεοτιδάσες Νουκλεοζίδια Νουκλεοζίδια νουκλεοσιδάσες Βάσεις + 1-Ρ- ριβόζη Αδενοσίνη Υποξανθίνη Γουανίνη Ξανθίνη Ουρικό οξύ Ξανθινοοξειδάση

Καταβολισμός νουκλεοτιδίων πουρίνης

Το ουρικό οξύ είναι το απεκκρινόμενο τελικό προϊόν του μεταβολισμού των πουρινών στα πρωτεύοντα, τα πτηνά και μερικά άλλα ζώα. Ένας υγιής ενήλικας απεκκρίνει ουρικό οξύ με ρυθμό 0,6 gr/24h.

Ανεπάρκεια της δεαμιδάσης της αδενοσίνης (ΑDΑ): βαρειά ανοσοανεπάρκεια εξ’ αιτίας διαταραχών της ωρίμανσης των Τ και Β- λεμφοκυττάρων. Η έλλειψη της ADA οδηγεί σε 100πλασια αύξηση της κυτταρικής συγκέντρωσης του dATP που είναι ισχυρός αναστολέας της αναγωγάσης των ριβονουκλεοτιδίων. Τα υψηλά επίπεδα των dATP προκαλούν γενική ανεπάρκεια των υπόλοιπων dNTPs στα Τ-λεμφοκύτταρα .Οι ασθενείς δεν επιζούν παρά μόνο σε στείρο κλουβί. Είναι ένας από τους πρώτους στόχους κλινικών δοκιμών γονιδιακής θεραπείας στον άνθρωπο

Οδοί διάσωσης Ελεύθερες βάσεις πουρίνης και πυριμιδίνης παράγονται συνεχώς στα κύτταρα κατά την μεταβολική αποδόμηση των νουκλεοτιδίων. Οι ελεύθερες πουρίνες σε μεγάλο βαθμό διασώζονται και ξαναχρησιμοποιούνται για τη σύνθεση νουκλεοτιδικών. Αδενίνη+ PRPPΑΜΡ +ΡΡι (φωσφοριβοζυλοτρανσφεράση της αδενοσίνης) Η ελεύθερη γουανίνη και υποξανθίνη διασώζονται κατά τον ίδιο τρόπο από τη φωσφοζυλοτρανσφεράση υποξανθίνης-γουανινης.

Διαταραχές του μεταβολισμού των πουρινών Έλλειψη φυλικού οξέος Υπερουριχαιμία-Ουρική αρθρίτιδα (ουρικό οξύ στο αίμα, εναπόθεση κρυστάλλων ουρικού νατρίου στις αρθρώσεις, σχηματισμός νεφρολίθων) Ξανθινουρία (έλλειψη ξανθινοοξειδάσης) Σύνδρομο Lesch-Nyhan (ολική έλλειψη της υποξανθινογουανινοφωσφοριβοσυλοτρανσφεράσης)

Σύνδρομο Lesch-Nyhan Κληρονομούμενο με υπολειπόμενο φυλοσύνδετο χαρακτήρα Οφείλεται σε πλήρη έλλειψη του ενζύμου υποξανθινογουανινοφωσφοριβοτρανσφεράσης Χαρακτηρίζεται από υπερουριχαιμία + νευρολογικές εκδηλώσεις (πνευματική καθυστέρηση, αυτοκαταστροφικές τάσεις, σπαστικότητα) Ο εγκέφαλος εξαρτάται στενά από τις αντιδράσεις περίσωσης για σύνθεση IMP και GMP Υποξανθινογουανινοφωσφο ριβοσυλοτρανσφεράση PRPP + Γουανίνη (Υποξανθίνη) GMP (IMP) + PPi

Σύνδρομο Lesch-Nyhan

Ουρική αρθρίτιδα (αυξημένη παραγωγή-ελαττωμένη απέκκριση του ουρικού οξέος) Τα φυσιολογικά επίπεδα του ουρικού οξέος στον άνθρωπο είναι κοντά στα όρια της διαλυτότητάς του (0.4mmol/L). Στην πορεία εξέλιξης των πρωτευόντων θηλαστικών έχουμε μια εντυπωσιακή αύξηση των επιπέδων του ουρικού οξέος Το ουρικό οξύ είναι ισχυρό αντιοξειδωτικό (όσο και η βιταμίνη C) δηλαδή συλλέκτης αντιδραστικών ριζών οξυγόνου.

Ουρική αρθριτιδα: Αρθρώσεις: Πόνο και φλεγμονή (εναποθέσης κρυστάλλων ουρικού νατρίου).Νεφρικές βλάβες. Εναπόθεση κρυστάλλων ουρικού μονονατρίου στις αρθρώσεις των άκρων (κυρίως) με τη μορφή τόφων. (τενόντια έλυτρα, υποδόριο, νεφρικό μυελό) Σε μερικές περιπτώσεις εμπλέκεται μια γενετική ανεπάρκεια σε κάποιο από τα ένζυμα μεταβολισμού των πουρινών. Αντιμετωπίζεται με συνδυασμό φαρμάκων και δίαιτας . Τροφές πλούσιες σε νουκλεοτίδια και νουκλεϊνικά οξέα απαγορεύονται. Αλλοπουρινόλη: αναστέλλει την οξειδάση της ξανθίνης, το ένζυμο που μετατρέπει τις πουρίνες σε ουρικό οξύ

Αναστολή του ενζύμου οξειδάσης της ξανθίνης Αλλοπουρινόλη Υποξανθίνη Συναγωνιστικός αναστολέας του ενζύμου

Ουρική αρθρίτιδα

Xημειοθεραπευτικά Τα καρκινικά κύτταρα έχουν μεγαλύτερες απαιτήσεις από τα φυσιολογικά για νουκλεοτίδα. Μια μεγάλη ομάδα χημειοθεραπευτικών περιλαμβάνει ουσίες που δρουν αναστέλλοντας ένα ή περισσότερα ένζυμα αυτών των οδών.

Ενώσεις που αναστέλλουν τις αμιδοτρανσφεράσες της γλουταμίνης (αζασερίνη, ασιβισίνη) H γλουταμίνη είναι δότης αζώτου σε τουλάχιστον έξι διαφορετικές αντιδράσεις στη βιοσύνθεση των νουκλεοτιδίων.

Άλλοι στόχοι για τη δράση χημειοθεραπευτικών είναι η συνθάση του θυμιδυλικού και αναγωγάση του διϋδροφυλικού, ένζυμα που παρέχουν στο κύτταρο τη μοναδική οδό για τη σύνθεση της θυμίνης. Φθοριουρακίλη:αναστολέας που δρα στην συνθάση του θυμιδιλικού. Δεν είναι η ίδια αναστολέας της συνθάσης του θυμιδιλικού. Οδοί διάσωσης την μετατρέπουν στο μονοφωσφορικό δεοξυνουκλεοσίδιο FdUMP, το οποίο προσδένεται στο ένζυμο και το απενεργοποιεί. Μεθοτρεξάτη: αναστολέας της αναγωγάσης του διϋδροφυλικού ( το ένζυμο προσδένει την μεθοτρεξάτη με 10πλάσια συγγένεια εν σχέση με το ένζυμο).

Τριμεθοπρίνη: αντιβιοτικό , προσδένει την βακτηριακή αναγωγάση του διϋδροφυλικού 100000 φορές καλύτερα από το ενζυμο των θηλαστικών.

Η σύνθεση του θυμιδιλικού και ο μεταβολισμός των φυλλικών ως στόχοι χημειοθεραπευτικών

Καταβολισμός μιας πυριμιδίνης

Αναστολείς των αμιδοτρανσφερασών της γλουταμίνης