ΕΙΔΙΚΑ ΚΕΦΑΛΑΙΑ ΚΥΤΤΑΡΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ Διάλεξη: «ΔΟΜΗ ΚΑΙ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΤΗΣ ΕΡΥΘΡΟΚΥΤΤΑΡΙΚΗΣ ΜΕΜΒΡΑΝΗΣ» Παρουσίαση: Δρ. Μ.Χ. Αντωνέλου, 07/05/08 http://kyttariki.biol.uoa.gr, http://multimedia.biol.uoa.gr Ιστοσελίδες μαθημάτων ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου

ΣΚΕΛΕΤΟΣ Εκχύλιση κυττάρου με Triton X-100 3D structure βιμεντίνη δεσμίνη 3D structure ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου

ΣΚΕΛΕΤΟΣ σκελετοί Sp’s 2D-structure 4.1 actin ίχνη Hb σκελετοί Κοντά πρωτονημάτια ακτίνης (33-37 nm) 2D-structure ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου

ΣΚΕΛΕΤΟΣ Iδιαίτερα ανεπτυγμένος (65%)  εξασφαλίζει μηχανικές ιδιότητες ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου

ΣΚΕΛΕΤΟΣ Αυτό το μοντέλο βρίσκει εφαρμογή και σε άλλους ιστούς/κύτταρα/ οργανίδια με διαφορετική όμως οργάνωση και λειτουργία ΣΗΜΕΙΑ ΣΥΝΔΕΣΗΣ: Sp-ank (band 3) (***) Sp-4.1R-actin-p55-GpC Rh, RhAG-ank Sp, 4.1R  PS ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου

ΣΚΕΛΕΤΟΣ Πυκνό και νηματώδες δίκτυο, αλλά με έκταση και αρνητική χρώση… (Liu et al., 1987; J.Cell Biol., 104:527-536) (Palek & Sahr,1992) ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου

ΣΚΕΛΕΤΟΣ

ΣΚΕΛΕΤΟΣ ΣΥΜΠΛΟΚΑ ΖΕΥΞΗΣ: Τα κομβικά σημεία διασταύρωσης των SpT μεταξύ τους και με τα πρωτονημάτια ακτίνης Οριζόντιες διαπρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις σε επίπεδο SK 240-360 ΣΖ/μm2 ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου

ΣΠΕΚΤΡΙΝΗ Eκτεταμένο, γραμμικό, εύκαμπτο, αρθρωτό, πολυλειτουργικό μόριο α, β υπομονάδες, ΑΥΤΟΣΥΓΚΡΟΤΟΥΜΕΝΕΣ σε διμερή, τετραμερή Πλευρική και αντιπαράλληλη σύνδεση (αβ) Head-to-head of 2 (αβ)  tetramer α2β2 3-6 nm, 200-260 nm ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου

ΣΠΕΚΤΡΙΝΗ Αρχαίες πρωτεΐνες, αλλά στην εξελιγμένη τους μορφή υπάρχουν μόνο στα μετάζωα 2 γονίδια α (chr1), 4 β-, 1 γονίδιο β-Η (chr14) (human) Συνδυασμοί ετεροτετραμερή  λειτουργίες Σκελετικός μυς, Golgi  homo-Τ-β Eπιθήλια, νευρικό σύστημα αρχετυπικό μέλος υπεροικογένειας Sp και δικτύων Sp σε άλλα κύτταρα, υποκυτταρικά οργανίδια και ιστούς ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου

ΣΠΕΚΤΡΙΝΗ Μοριακό ελατήριο Διμερή: 29-37 nm in situ, 100 nm σε έκταση ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου

ΣΠΕΚΤΡΙΝΗ * Επαναλήψεις δομής τριπλής έλικας 22 domains 19 domains Οι τριπλές έλικες σταθεροποιούνται από αλληλεπιδράσεις ανάμεσα σε υδρόφοβα κατάλοιπα που βρίσκονται σε συγκεκριμένες αποστάσεις μεταξύ τους ακολουθώντας ένα επαναλαμβανόμενο πρότυπο Ελατήρια προασαρμοζόμενου μήκους Δομική ομολογία, αλλά εν μέρει διαφορετικά λειτουργικά μόρια (αποικ) ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου

ΣΠΕΚΤΡΙΝΗ 1D-SDS-PAGE 2D-electrophoresis Υπο-domains κάθε υπομονάδας ανθεκτικά στη θρυψίνη (HE) ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου

ΣΠΕΚΤΡΙΝΗ Oι σπεκτρίνες είναι μόρια αυτοσυγκροτούμενα, υψηλή συγγένεια αλληλεπ. Η αυτοσυγκρότηση in vitro είναι ανάλογη ΤoC και [Sp] In vivo (37oC) ευνοούνται τα ΤSp λόγω πολύ υψηλής [Sp] Tα TSp είναι η φυσιολογική μορφή συγκρότησης της Sp στο Sk (HE)

ΣΠΕΚΤΡΙΝΗ Πυρήνωση ετεροδιμερούς α19-α22 β1-β4 Αρχικά αναπτύσσονται ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις ανάμεσα σε α και β-υπομονάδες στη θέση πυρήνωσης οι οποίες εξασφαλίζουν το ζευγάρωμα στη σωστή φάση των τριπλετών κατά μήκος του διμερούς. Μετά την αρχική διασύνδεση, το διμερές σταθεροποιείται από υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις ανάμεσα στις έλικες (ασθενείς, αλλά πολλές), και περιελίσσεται η μία υπομονάδα γύρω από την άλλη σα σχοινί. ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου

ΣΠΕΚΤΡΙΝΗ Αυτοσυγκρότηση ετεροτετραμερούς α1 α2 β17 υβριδική τριπλέτα Mη-ομοιοπολική διασύνδεση, ενδογενής ιδιότητα (Hb) ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου

ΣΠΕΚΤΡΙΝΗ Αυτοσυγκρότηση ετεροτετραμερούς pH Ιοντική ισχύ Θερμοκρασία Συγκέντρωση Sp Υψηλής-συγγένειας Sp-Ank  τοπικές  [Sp] υπομεμβρανικά που ευνοούν τον ολιγομερισμό Αντίθετα, η διασύνδεση Sp-actin είναι χαμηλής συγγένειας (μη-αυτοσυγκροτούμενη) και χρειάζεται την 4.1R Συνδέσεις Sp: διαμεμβρανικές πρωτεΐνες απευθείας διαμέσου ank με φωσφολιπίδια ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου

ΑΚΤΙΝΗ Μόνο β-ισομορφή (βγ) Κοντά πρωτονημάτια 33-37 nm (δευτεροταγής δομή, αλληλεπιδράσεις) Μονομερής ακτίνη (G) ΔΕΝ συμμετέχει στο Sk Aπαντάται στα σύμπλοκα ζεύξης μαζί με 4.1R και Sp Mετά την πρόσδεση ενός μορίου 4.1R προκαλούνται δομικές αλλαγές στο πρωτονημάτιο που ευνοούν την πρόσδεση extra 4.1R, Sp ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου

4.1R * Βοηθητική Sp-actin, GpC-p55 Σύμπλοκα ζεύξης 200.000 αντίγραφα/RBC Aρχετυπικό μέλος 4.1 family Eγκέφαλος, ήπαρ, έντερο, πάγκρεας, μετασυναπτικές μεμβράνες, πυρήνας, κυτταρικοί σύνδεσμοι Σχηματίζει πολυμοριακά σύμπλοκα με διαμεμβρανικές & άλλες πρωτεΐνες με ρόλο στη δομική σταθερότητα και μεταγωγή σήματος (Han et al., Nat.Struct.Biol., 7:871, 2000) ΑΝΚ * ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου

4.1R Οι αλληλεπιδράσεις της 4.1R ρυθμίζονται με φωσφορυλίωση και από το σύστημα calmodulin/Ca++ (αναστολή σύνδεσης σε μεμβράνη & Sp/actin). H πρόσδεση Ca++ στην calmodulin αυξάνει (20x) την πρόσδεση της calmodulin στην εξαρτώμενη από ασβέστιο θέση πρόσδεσης calmodulin της 4.1. Αυτό προκαλεί αλλαγή στη διαμόρφωση της 4.1 που επιφέρει εξασθένιση των αλληλεπιδράσεών της με τις p55, GpC, B3

4.1R Aρθρωτή πρωτεΐνη-3 domains: Ι. Πρόσδεσης σε μεμβράνη (PS, B3, p55, calmodulin) ΙΙ. Πρόσδεσης σε Sp/actin (σπονδυλόζωα, ΗΕ) III. COOH domain (απόλυτα συντηρημένο στα μετάζωα) Brain Θηλαστικά (εκτεταμένα γεγονότα εναλλακτικού ματίσματος και θέσεων έναρξης ΜΦΡ mRNA) RBC General Neuron ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου

Ghosts (Laemmli-linear 5-15%) Ο καλύτερος δείκτης της ηλικίας του RBC SDS-PAGE: 4.1α/β, 80 & 78 kDa Μετα-ΜΦΡ τροποποίηση της Asn502 που συμβαίνει σταδιακά και αργά και προκαλεί β α. 4.1β/α: περιφερική αιμόλυση, αυξημένα ΔΕΚ Πρόκειται για κοινό μηχανισμό σε πολλά είδη θηλαστικών αλλά η τιμή του λόγου διαφέρει από είδος σε είδος. 4.1(-)  ΗΕ Ghosts (Laemmli-linear 5-15%) ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου

ΑΔΟΥΣΙΝΗ Sp/actin Phosphor. calmodulin Προάγει σχηματισμό ολιγομερών Sp/actin Phosphor. calmodulin Αλληλεπιδρά με άλλες υπομονάδες αδουσίνης Βοηθητική πρωτεΐνη του συμπλόκου Sp-actin (τριαδικό σύμπλοκο) Υπάρχει μόνο στα μετάζωα Άνθρωπο: 3 υπομονάδες/γονίδια (α, β, γ) RBC: ετεροδιμερή αβ, 15.000 μόρια/RBC (διμερή και τετραμερή)

ΑΔΟΥΣΙΝΗ Πρωτεΐνη κάλυψης των νηματίων ακτίνης (παρεμποδίζει μεταβολή μήκους τους και προάγει πρόσδεση Sp). Συνδέεται απευθείας σε ακτίνη αλλά με μεγαλύτερη συγγένεια σε Sp/actin ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου

p55 Μέλος οικογένειας MAGUKs (Membrane-associated Guanylate kinase homologues) Οργάνωση Sk στοιχείων, κυτταρική σήμανση, cell proliferation, καταστολή όγκων RBC: SDS-PAGE band 4.9 4.1-GpC (δένει και στις δύο, αλλά δεν επιδρά στη συγγένεια αλληλεπίδρασης) (-)4.1R, (-)GpC  ολοκληρωτική απώλεια p55 ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου

ΔΕΜΑΤΙΝΗ Zώνη 4.9 Τριμερή (48, 52 kDa), 43.000/RBC Σφαιρική δομή Πακετάρισμα ακτίνης σε δέσμες Σύμπλοκο ζεύξης Με φωσφορυλίωση αναστέλλεται η λειτουργικότητά της ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου

ΤΡΟΠΟΜΥΟΣΙΝΗ (ΤΜ) Actin-binding protein 2 μονομερή που αυτοσυγκροτούνται κεφαλή με ουρά κατά μήκος των αυλάκων της διπλής έλικας ακτίνης Καθορίζουν μήκος 33-37nm Έμμεσα ρυθμίζουν SpT 4 γονίδια (α, β, γ και δ) RBC: 29/27 kDa, 70-80.000 copies/RBC Σύμπλοκα ζεύξης: ΤΜ5 (γ) και TM5b (α) σε ομο- ή ετεροδιμερή 1) Αλληλεπιδρούν με 6 μόρια ακτίνης, 2)  συγγένεια για ΤD/actin ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου

ΤΡΟΠΟΜΟΝΤΟΥΛΙΝΗ (TD) Πρωτεΐνη κάλυψης ΤΜ Σφαιρική 40.6 kda (πρώτα σε RBC) Iσομοριακή με ΤΜ. Αναστέλλει: 1)Συνεργατικότητα ΤΜ 2) Επιμήκυνση / αποπολυμερισμό ακτίνης ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου

ΜΟΝΤΕΛΟ SUNG et al., 2000 Γεωμετρία εξαγωνικών πλεγμάτων Sk Στην πτυχωτή επιφάνεια της ΤΜ5 δημιουργείται μία θέση πρόσδεσης ΤD Η ΤΜ5 έχει 6 θέσεις πρόσδεσης ακτίνης Το σύμπλοκο ΤΜ5/TD καθορίζει ως χάρακας το μήκος ακτίνης 33-37 nm Tα πρωτονημάτια ακτίνης ευνοούν την πρόσδεση 6 SpT Γεωμετρία εξαγωνικών πλεγμάτων Sk ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου

ΑΓΚΥΡΙΝΗ Sp (T) 10x Πρωτεΐνη-συνδέτης (215 kDa), φωσφορυλίωση Αρθρωτή (4 domains) Domain πρόσδεσης σε μεμβράνη (24 αντίγραφα αλληλουχίας 33αα Επαναλήψεις ΑΝΚ) Nεκρικό domain Sp (T) 10x COOH-domain ρύθμισης (εναλλακτ.μάτισμα) 2.2* ank (186 kDa), ανθρώπινη αγκυρίνη ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου

ΑΓΚΥΡΙΝΗ (-) ank  band 3 dimers Μεταγραφικοί παράγοντες, σκελετικές πρωτεΐνες, τοξίνες Μηχανισμοί αναγνώρισης και πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου

ΑΓΚΥΡΙΝΗ Μεταγωγή σήματος, Ενδοκυττάρωση, Πολωμένη κατανομή πρωτεϊνών στη μεμβρ. (Restricted, Broadly, Giant) (2.400αα) Μακροφάγα Πολυπρωτεϊνικά σύμπλοκα ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου

ΠΑΛΛΙΔΙΝΗ (4.2) 72 kDa, 200.000 copies/RBC Περιφερική με υδρόφοβες ιδιότητες Φωσφορυλιωμένη Ν-myristylated (myristic acid) Παλμιτιλιωμένη (palmitic acid) (b3,p55) Το πρόσθετο υδρόφοβο τμήμα  αλληλεπιδράσεις με μεμβράνη (-) ΙΙΙ exon  επιθηλιακά κύτταρα Εγκέφαλος, Νεφροί, Λεμφοκύτταρα, PLT Tετραμερή-Hereditary spherocytosis-like (hemolytic anemia, εύθρ.RBC) Band 3 (* ενίσχυση σύνδεσης Β3-Sk, εκχύλιση), ank, 4.1R(?), ΑΤΡ ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου

ΣΚΕΛΕΤΟΣ Oργάνωση αντιστρεπτά μεταβλητή –Πυκνός-Ελαστικός-Εκτατός Σύμφωνα με ένα μοντέλο, η διαφορετικού βαθμού συμπίεση συγκεκριμένων μορίων Sp προκαλεί αλλαγές στο γεωμετρικό σχήμα του Sk και αντιστρ.παραμόρφωση της μεμβράνης αλλά όχι αλλαγή στη συνολική επιφανειακή έκταση (ΣΖ, θραύση) ΣΖ 2.8x 8x

μη-ενζυματική γλυκοζυλίωση ακυλίωση λιπαρών οξέων ΣΚΕΛΕΤΟΣ  Αλληλεπιδράσεων   deformability (HE)  Αλληλεπιδράσεων σε ΣΖ   membrane stability (HS) AYTOΣΥΓΚΡΟΤΗΣΗ ΣΥΜΠΛΟΚΩΝ ΚΑΙ ΣΚΕΛΕΤΟΥ: Βοηθητικές πρωτεΐνες Ca++/calmodulin/calpain Phosphorylation Μετα-ΜΦΡ τροποποιήσεις: ΔΟΜΙΚΕΣ Ή ΡΥΘΜΙΣΤΙΚΕΣ Μη-αντιστρεπτές μυριστιλίωση 4.2 οξείδωση μη-ενζυματική γλυκοζυλίωση πρωτεόλυση Αντιστρεπτές φωσφορυλίωση ακυλίωση λιπαρών οξέων ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου

ΣΚΕΛΕΤΟΣ Ο Σκελετός ως μηχανισμός διαλογής πρωτεϊνών στο ερυθροκύτταρο Η εξωκυστιδιοποίηση ρυθμίζεται από αλληλεπιδράσεις του Sk με τη μεμβράνη Σκελετοί Sp-ANK εκτός της ερυθροκυτταρικής μεμβράνης Δομική υποστήριξη κυτταρικής μεμβράνης Ρύθμιση κατανομής/λειτουργίας διαμεμβρανικών πρωτεϊνών και μεμβρ. ενζύμων σε πολωμένα κύτταρα Διαλογή πρωτεϊνών Αρχιτεκτονική πυρήνα κατά τη μίτωση Ρύθμιση μονοπατιών μεταγωγής σήματος

ΣΚΕΛΕΤΟΙ Sp-Ank RBC Πυκνοί Εκτεταμένοι Ομοιογενείς Κοντά πρωτονημάτια ακτίνης ΕΚΤΟΣ RBC Σποραδικοί Μακρύτερα νημάτια ακτίνης Μικροσωληνίσκοι (δυνείνη, δυνακτίνη) υποδοχείς/ microdomains/πρωτεΐνες μη-RBC Επιθήλια, Νευρικό, Golgi ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου

GOLGI Διατήρηση δομής, δυναμικής φύσης, διαμερισματοποίησης Διαλογέας πρωτεϊνών ανάλογος της κλαθρίνης στα καλυμμένα βοθρία Προσδένει ποικιλία πρωτεϊνών Επιλεκτική συγγένεια 2D-ολιγομερείς δομές Κατάσταση δυναμικής συγκρότησης Ρυθμίζει συγκράτηση πρωτεϊνών στις μεμβράνες Golgi εμποδίζοντας την είσοδό τους σε εκκριτικά κυστίδια μεταφοράς ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου

ΒΙΟΓΕΝΕΣΗ ΥΠΟΜΕΜΒΡΑΝΙΚΟΥ ΣΚΕΛΕΤΟΥ ΒΙΟΓΕΝΕΣΗ ΥΠΟΜΕΜΒΡΑΝΙΚΟΥ ΣΚΕΛΕΤΟΥ Στα τελικά στάδια της ωρίμανσης ερυθροβλαστών σε ΔΕΚ, RBC σημειώνονται ριζικές αλλαγές (nucl., TfR, microtub, membr, Sk, S/V) Διαφοροποίηση δομικών συστατικών ερυθροβλάστεςRBC Οι Sk πρωτεΐνες συντίθενται/συγκροτούνται σε Sk σε διαφορετικές φάσεις κατά την ερυθροποίηση και σε ποικίλοντα ποσά Με την ωρίμανση αλλάζουν οι μηχανικές ιδιότητες κυττάρων (στα ΔΕΚ η διασύνδεση Sk  μεμβράνης είναι ακόμα ασθενής) (?) Ο Sk αυτοσυγκροτείται (Μετα-ΜΦΡ) αλλά ή αυτοσυγκρότηση πρέπει να γίνεται υπομεμβρανικά. επιλεκτική/ταχεία αποικοδόμηση β-σπεκτρίνης μεμβρανικοί υποδοχείς (akn) 3. «βοηθητικές πρωτεΐνες» (4.1R, TM5-TD) ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου

ΒΙΟΓΕΝΕΣΗ ΥΠΟΜΕΜΒΡΑΝΙΚΟΥ ΣΚΕΛΕΤΟΥ ΒΙΟΓΕΝΕΣΗ ΥΠΟΜΕΜΒΡΑΝΙΚΟΥ ΣΚΕΛΕΤΟΥ Η βιογένεση είναι μία σπάταλη διαδικασία (2-3x αSp/β) Η σύναψη συμπλόκων σταθεροποιεί τα μόρια και τα προστατεύει από τον καταβολισμό. Sp, ank  ασταθές/παροδικό προ-συγκροτούμενο κυτταροσκελετικό δίκτυο (ανακύκλωση, 10% παροδική συγκρότηση) Band 3, 4.1  ευσταθές membrane-associated system  σύνθεση Sp, actin, ank,  ανακύκλωση,  συγκρότηση σε Sk  σύνθεση Band 3, 4.1 (isoforms) Ανθρώπινοι προερυθροβλάστες in situ σύγχρονη σύνθεση b3/Sp/ank. (-/-)ΑΕ1 mouse  φυσιολογική συγκρότηση Sk κατά τη διαφοροποίηση ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου

ΤΕΛΟΣ Α’ ΜΕΡΟΥΣ ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου