ΚΥΤΤΑΡΙΚΟΣ ΚΥΚΛΟΣ - ΓΗΡΑΝΣΗ Ιωάννης Π. Τρουγκάκος Τομέας Βιολογίας Κυττάρου & Βιοφυσικής Τμήμα Βιολογίας, Παν/μιο Αθηνών

15.1. Κυτταρική αύξηση και διαίρεση 15.2. Μεσόφαση 15.2.1. Ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου κατά τη μεσόφαση – Η εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου εξαρτάται από διακριτά σημεία ελέγχου 15.2.1.1. Ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου κατά τη μεσόφαση σε κατώτερα ευκαρυωτικά κύτταρα 15.2.1.2. Ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου κατά τη μεσόφαση στα κύτταρα των θηλαστικών 15.2.2. Ρύθμιση των σημείων ελέγχου του κυτταρικού κύκλου 15.3. Μίτωση και κυτταροκίνηση 15.3.1. Πρόφαση 15.3.2. Προμετάφαση 15.3.3. Μετάφαση 15.3.4. Ανάφαση 15.3.5. Τελόφαση 15.3.6. Κυτταροκίνηση 15.3.7. Μηχανισμοί που ελέγχουν τη μίτωση 15.4. Μείωση 15.4.1. Τα στάδια των μειωτικών διαιρέσεων Ι, ΙΙ ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 15.5. Κυτταρική γήρανση 15.5.1. Ο φαινότυπος της κυτταρικής γήρανσης 15.5.2. Η τελομεράση και το όριο Hayflick 15.6. Κλωνοποίηση οργανισμών 15.6.1. Ιστορική αναδρομή 15.6.2. Τεχνικές κλωνοποίησης οργανισμών 15.6.3. Παράγοντες που επηρεάζουν την ανάπτυξη των εμβρύων που προκύπτουν από κλωνοποίηση 15.6.4. Επαναπρογραμματισμός του γενετικού υλικού του δότη - Μελλοντικές προοπτικές - Ηθικά διλήμματα. Βιβλιογραφία

Ρύθμιση σχετικής συγκέντρωσης κυκλινών μέσω αποδόσης στο πρωτεάσωμα Παράλληλα, κατά την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου μεγάλα πρωτεϊνικά σύμπλοκα είναι δυνατόν να μαρκάρουν είτε κάποιους ειδικούς αναστολείς των διαφόρων γεγονότων του κυτταρικού κύκλου είτε τις ίδιες τις κυκλίνες (εναλακτικός μηχανισμός ρύθμισης της ενεργότητας των Cyc-Cdk συμπλόκων) προωθόντας έτσι την αποδόμηση τους στο πρωτεόσωμα. Όταν η συγκέντρωση της Cyc είναι χαμηλή η Cdk λόγω απώλειας της Cyc είναι ανενεργή και ενεργοποιείται μόνο όταν η συγκέντρωση της Cyc υπερβεί κάποια όρια. NH2 COOH Κουτί καταστροφής Πρωτεόσωμα G1 S G2 M Συγκέντρωση κυκλινών Ενεργότητα MPF APC Πρωτεόλυση Ρύθμιση σχετικής συγκέντρωσης κυκλινών μέσω αποδόσης στο πρωτεάσωμα Σχετική συγκέντρωση κυκλινών και ενεργότητας MPF στις διάφορες φάσεις του κυτταρικού κύκλου

Οι ενεργότητες κινάσης που ελέγχουν τον κυτταρικό κύκλο εστιάζονται κυρίως σε δύο σημεία, τα οποία είναι η μετάβαση μεταξύ των σταδίων G1 - S και μεταξύ των σημείων G2 - Μ. Η πρόοδος του κυτταρικού κύκλου σε κάθενα από τα σημεία αυτά απαιτεί την παροδική ενεργοποίηση μιας Cdk από μια ειδική Cyc. Σε κάθε φάση δε η ενεργοποίηση οδηγεί στη φωσφορυλίωση μιας σειράς υποστρωμάτων. Για παράδειγμα στο σημείο G1S φωσφορυλιώνται κάποιοι μεταγραφικοί παράγοντες απαραίτητοι για την αντιγραφή του DNA. Στο σημείο G2M φωσφορυλιώνται κάποιοι άλλοι παράγοντες όπως η ιστόνη Η1 η φωσφορυλίωση της οποίας ίσως βοηθά στη συμπύκνωση των χρωμοσωμάτων και η πυρηνική λαμίνη της οποίας η φωσφορυλίωση οδηγεί στη διάλυση του πυρηνικού φακέλου κατά τη μίτωση. Παράλληλα φωσφορυλιώνονται και μια σειρά από κυτταροπλασματικές πρωτεϊνες που συμμετέχουν στη δυναμική αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού για τη μετάβαση από τη μεσόφαση στην μίτωση.

ΡΥΘΜΙΣΗ ΤΟΥ ΚΥΤΤΑΡΙΚΟΥ ΚΥΚΛΟΥ ΚΑΤΑ ΤΗ ΜΕΣΟΦΑΣΗ Σ Ε ΚΑΤΩΤΕΡΑ ΕΥΚΑΡΥΩΤΙΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ X G1 G2 M πυρηνική διαίρεση- κυττοκίνηση Cdc2+ Cdc2- Cdc2D Κυτταρικός κύκλος στο σακχαρομύκητα Μεταλλαγές που επηρεάζουν τον κυτταρικό κύκλο στο σακχαρομύκητα

Γενικά στους σακχαρομύκητες η ίδια Cdk (cdc2 στον S Γενικά στους σακχαρομύκητες η ίδια Cdk (cdc2 στον S. pombe και Cdc28 στον S. cerevisiae) είναι ενεργή και στα δύο κύρια σημεία ελέγχου (check points) αλλά ενεργοποιείται από διαφορετικές Cyc σε κάθε ένα από τα δύο αυτά σημεία ελέγχου. Το πρώτο σημείο μετάπτωσης ονομάζεται ΕΚΚΙΝΗΣΗ (START, ή R) και βρίσκεται πριν το τέλος της G1. Το πέρασμα από το START απαιτεί την ενεργοποίηση της Cdk από μια ή περισσότερες Cyc της φάσης G1 ενώ αντίθετα το πέρασμα από το σημείο G2Μ απαιτεί ενεργοποίηση της Cdk από άλλες μιτωτικές Cyc. Ειδικότερα η συγκέντρωση των Cyc κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου μεταβάλλεται συνεχώς λόγω αλλαγών στους ρυθμούς σύνθεσης και αποδόμοσης των μορίων αυτών. Ενα από τα σημαντικά υποστρώματα των συμπλόκων Cdk-Cyc κατά τη μετάβαση G1S είναι το σύμπλοκο πρόωθησης της ανάφασης (APC). Το σύμπλοκο αυτό έχει ενεργοποιηθεί κατά την ανάφαση της μίτωσης (που έχει προηγηθεί) πιθανώς μέσω φωσφορυλίωσης από τον παράγοντα MPF. O ενεργοποιημένος APC στη συνέχεια κατευθύνει τη πολυουμπικιτινίωση και έτσι τη αποδόμηση μέσω πρωτεασώματος του αναστολέα της ανάφασης, του αναστολέα των κυκλινών τύπου Β και κάποιων συστατικών της μιτωτικής ατράκτου. Η φωσφορυλίωση του APC από τα σύμπλοκα Cdk-Cyc απενεργοποιεί το μόριο στην όψιμη G1. Παράλληλα κατά τη φάση αυτή επάγεται η πρωτεόλυση του παράγοντα Sic1 που αποτελεί ισχυρό αναστολέα της S-φάσης. Τα κύτταρα μπαίνουν στη φάση S όταν ο Sic1 αποδομείται ταχύτατα λόγω ουμπικιτινίωσης από ένα διακριτό ένζυμο που ονομάζεται SCF.

M G2 S Μέση-Όψιμη G1 START Πρώιμη Πρωτεόλυση Sic1 Cdk-CycCs APC Cdk-CycB Μεταγραφή CycCs, CycDs Cdk-CycDs σύνθεση DNA Cdk-CycEs Σχηματισμός μιτωτικής ατράκτου Σύνθεση DNA Cdk-CycAs Διέγερση μίτωσης/ Διαίρεση πυρήνα (MPF) (απενεργοποίηση) Ενεργοποίηση APC Ολοκλήρωση μίτωσης/ Απενεργοποίηση MPF Σχετική μεταβολή της συγκέντρωσης των κυκλινών και των ενεργών συμπλόκων κινασών (μεγάλα βέλη) που σχηματίζονται κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου (και συνδέονται με συγκεκριμένα μοριακά γεγονότα) στο σακχαρομύκητα. Οι ονομασίες των Cyc σαν A, B, C κτλ είναι αυθαίρετη.

M G2 S Μέση-Όψιμη G1 START Πρώιμη Πρωτεόλυση Sic1 Cdc28-Cln1-, Cln2- APC Cdc28-Cln3 SBF, MBF Μεταγραφή Cln1-, Cln2 Clb5-, Clb6- Cdc28-Clb5-,6- σύνθεση DNA Cdc28-Clb3-, 4- Σχηματισμός μιτωτικής ατράκτου Cdc28-Clb1-, 2- Διαίρεση πυρήνα Σύνθεση DNA Διέγερση μίτωσης Σχετική μεταβολή της συγκέντρωσης των κυκλινών και των ενεργών συμπλόκων κινασών (μεγάλα βέλη) που σχηματίζονται κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου (και συνδέονται με συγκεκριμένα μοριακά γεγονότα) στο σακχαρομύκητα. Οι ονομασίες των Cyc σαν A, B, C κτλ είναι αυθαίρετη.

Καθώς τα κύτταρα ολοκληρώνουν το διπλασιασμό των χρωμοσωμάτων τους και μπαίνουν στη φάση G2 ενεργοποιούνται μια σειρά από άλλες Cyc που δρούν σαν μιτωτικές κυκλίνες και συδέονται με τη Cdk προκειμένου να δημιουργήσουν τα σύμπλοκα που απαιτούνται για τον αποχωρισμό των χρωμοσωμάτων και τη διαίρεση του πυρήνα. Είναι λοιπόν φανερό ότι κάθε ομάδα κυκλινών κατευθύνει την ενεργότητα κινάσης της Cdk σε ειδικές ανά φάση του κυτταρικού κύκλου λειτουργίες. Η είσοδος ενός κυττάρου στη μίτωση πυροδοτείται από την ενεργοποίηση μιας κινάσης που ονομάζεται MPF (maturation promoting factor ή Μ phase kinase) που όπως και τα υπόλοιπα σύμπλοκα αποτελείται από δύο υπομονάδες (μια Cdk και μια Cyc). Ειδικότερα η Cdk συνδέεται με μια μιτωτική κυκλίνη (Cyc) προκειμένου να δημιουργηθεί ένα διμερές που είναι ισοδύναμο του MPF. Επιπλέον της ρύθμισης από τις Cyc όμως η ενεργότητα της Cdk του MPF παράγοντα ελέγχεται και από τη κατάσταση φωσφορυλίωσης της που στο σακχαρομύκητα ρυθμίζεται από τουλάχιστον δύο κινάσες (Weel, CAK) και μια φωσφατάση (cdc25) όπου η Wee1 και η cdc25 δρουν σαν ανταγωνιστές απενεργοποιώντας ή ενεργοποιώντας τη cdk αντίστοιχα. Ο ανταγωνισμός αυτός είναι κρίσιμος για την έναρξη της μίτωσης αφού καθώς τα κύτταρα μπαίνουν στη μίτωση η ενεργότητα της Wee1 πέφτει ενώ της Cdc25 ενισχύεται έχοντας σαν αποτέλεσμα την περαιτέρω ενεργοποίηση του συμπλόκου Cdk-Cyc (MPF). Είναι σαφές πάντως ότι εκτός από τις μεταβολές στα επίπεδα φωσφορυλίωσης κάποιων μορίων οι σημαντικές φάσεις του κυτταρικού κύκλου (έναρξη της φάσης S και της ανάφασης και η έξοδος από τη μίτωση) ελέγχονται και μέσω ρυθμιζόμενης πρωτεόλυσης που κατευθύνεται από ειδικά σύμπλοκα ουμπικιτινίωσης (όπως για παράδειγμα αυτά των Cdk-APC ή Cdk-SCF).

ΡΥΘΜΙΣΗ ΤΟΥ ΚΥΤΤΑΡΙΚΟΥ ΚΥΚΛΟΥ ΚΑΤΑ ΤΗ ΜΕΣΟΦΑΣΗ Σ Ε ΚΥΤΤΑΡΑ ΘΗΛΑΣΤΙΚΩΝ Σε αντίθεση με τους σακχαρομύκητες όπου σε όλα τα στάδια φαίνεται να δρα ο η ίδια cdk (cdc2 ή Cdc28), στα θηλαστικά η εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου είναι σημαντικά πιό πολύπλοκη αφού μέχρι τώρα στα κύτταρα αυτά έχουν απομονωθεί αρκετές τόσο Cyc όσο και Cdks που φαίνεται να συμμετέχουν ενεργά στην εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου. Εδώ βέβαια η σύνδεση Cyc-cdk είναι ειδική και μόνο συγκεκριμένοι συνδυασμοί συμπλόκων Cyc-Cdk απαντώνται Οι κύριες Cdks έχουν ονομαστεί 1, 2, 3 στη βάση της σειράς απομόνωσης τους. Η Cdk1 είναι η ομόλογη της cdc2, ενώ η Cdk2 εμφανίζει μεγάλη ομολογία με την cdc28. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι ούτε οι Cyc ούτε οι Cdks εκφράζονται (παράγονται) απουσία μιτογόνων γεγονός που δικαιολογεί την απουσία διπλασιασμού κυττάρων που βρίσκονται σε φάση G0. Η προσθήκη μιτογόνων σε κύτταρα θηλαστικών που βρίσκονται στη φάση G0 επάγει την προώθηση του κυτταρικού κύκλου μέσω της ενεργοποίησης πολλαπλών γονιδίων που ομαδοποιούνται σε δύο κατηγορίες. Σε αυτά τις πρώϊμης απόκρισης και σε αυτά της όψιμης απόκρισης (η ονοματολογία εξαρτάται από το πόσο γρήγορα ενεργοποιούνται τα γονίδια αυτά). Η επαγωγή των γονιδίων αυτών δεν μπλοκάρεται απο αναστολείς πρωτεϊνοσύνθεσης αφού οι μεταγραφικοί τους παράγοντες υπάρχουν ήδη στο κύτταρο οπότε μετά από το κατάλληλο σινιάλο από ένα αναπτυξιακό παράγοντα ενεργοποιούνται με μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις όπως για παράδειγμα φωσφορυλίωση.

c-fos c-myc 30 60 90 2 4 6 8 10 Προσθήκη ορού 5 15 Σχετική ενεργότητα Τα πιο πολλά από τα πρώιμα ενεργοποιούμενα γονίδια κωδικοποιούν μεταγραφικούς παράγοντες όπως είναι το c-fos ή το c-jun τα οποία με τη σειρά τους ενεργοποιούν τη μεταγραφή των όψιμων γονιδίων. Μετά δε από μια αρχική κατακόρυφη αύξηση της συγκέντρωσης των πρωτεϊνών αυτών που διαρκεί για περίπου 30 λεπτά η συγκέντρωση τους μειώνεται και παραμένει σε κάποιο μέσο επίπεδο για όσο χρόνο υπάρχουν σινιάλα από τα μιτογόνα. Εάν η συγκέντρωση των μιτογόνων για κάποιο λόγο μειωθεί η μεταγραφή των γονιδίων αυτών αναστέλλεται και δεδομένου ότι οι ήδη παραχθείσες πρωτεΐνες είναι ασταθείς η συγκέντρωση τους πέφτει γρήγορα. Έτσι αν το κύτταρο δεν έχει περάσει το σημείο START δεν ξεκινά το διπλασιασμό του DNA.

Αναπτυξιακοί Ιοικοί Υποδοχείς Πρωτεϊνες Αντι-αποπτωτικά Μεταγραφικοί παράγοντες Αναπτυξιακοί Υποδοχείς αναπτυξιακών παραγόντων Αντι-αποπτωτικά γονίδια Πρωτεϊνες μεταγωγής σήματος Ενδοκυττάριοι υποδοχείς Πρωτεΐνες επιδιόρθωσης DNA Πρωτεΐνες ελέγχου κυτταρικού κύκλου Ιοικοί ενεργοποιητές υποδοχέων Η έκφραση των όψιμων ενεργοποιούμενων γονιδίων προϋποθέτει την ύπαρξη των πρωϊμων πρωτεϊνών – κάποιες από τις οποίες ειναι ο παράγων E2F, οι κυκλίνες τύπου D, η Cyc-E και οι Cdks 2-, 4- και 6-. Oι Cdks4, 6 και οι κυκλίνες τύπου D εκφράζονται πρώτες και μετά ακολουθούν οι Cyc-Ε και η Cdk2. Ετσι κατά την διάρκεια της G1 η ποσότητα των D-τύπου κυκλινών αυξάνεται και τελικά οι πρωτεϊνες αυτες συνδέονται και ενεργοποιούν τις Cdk4 και Cdk6. Το πρώτο αυτό κύμα ενεργότητας κινασών που εξαρτάται από τις D κινάσες ακολουθείται στην όψιμη G1 από μια αύξηση στην ενεργότητα της Cdk2 που ακολουθείται από ενεργοποίηση των συμπλόκων Cdk2-CycE και Cdk2-CycA.

Μεγάλη ενεργότητα κινάσης M G2 S G1 Σημείο Περιορισμού G0 Cdk2-CycΕ Cdk1-Cycs Α,B 6-12 hrs 6-8 hrs 3-4 hrs 1 hr Cdk2-CycA Cdks 4, 6- (5?) Cycs D1,2,3 E2F1,2,3 E2F4,5 Μεγάλη ενεργότητα κινάσης Μικρή ενεργότητα κινάσης Ενεργότητα των συμπλόκων κυκλινών και κυλινο-εξαρτώμενων κινασών (τόξα) κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου σε κύτταρα θηλαστικών (τα οποία είναι δυνατόν να βρίσκονταν σε φάση G0 και έχουν διεγερθεί μέσω μιτογόνων να εισέλθουν στον κυτταρικό κύκλο). Το πλάτος των γραμμών (τόξα) απεικονίζει χονδρικά την ενεργότητα των συμπλόκων Cdk-Cyc που αναφέρονται σε κάθε φάση του κυτταρικού κύκλου. Τα σκιασμένα βέλη στη φάση G1 υποδεικνύουν την ενεργοποίηση των μελών της οικογένειας του μεταγραφικού παράγοντα E2F από το αντίστοιχο Cdk-Cyc σύμπλοκο.

ΔΡΑΣΗ ΑΝΑΠΤΥΞΙΑΚΩΝ ΠΑΡΑΓΟΝΤΩΝ ΣΕ ΚΥΤΤΑΡΑ ΘΗΛΑΣΤΙΚΩΝ Αναπτυξιακός παράγοντας Κινάση Α Κινάση Β Πρώιμα γονίδια Όψιμα γονίδια RI TGFβ Smad3 Smad4 RII

Γενικά η προώθηση του κυτταρικού κύκλου πέρα από το σημείο ελέγχου R (restriction point) εξαρτάται από την ενεργότητα των μεταγραφικών παραγόντων της οικογένειας E2F. Οι μεταγραφικοί αυτοί παράγοντες απαιτούνται για την μεταγραφή αρκετών γονιδίων όπως είναι οι Cyc-Α,-Ε και Cdk2-, ενώ επιπλέον οι E2F ενεργοποιούν και τα ίδια τους τα γονίδια (αυτοενεργοποίηση). Η μεταγραφική ενεργότητα των E2F παραγόντων αναστέλεται είτε από τη πρόσδεση της πρωτεϊνης του ρετινοβλαστώματος (pRb) είτε από την πρόσδεση δύο σχετίζομενων πρωτεϊνών των p107 και p130.

Το γεγονός που επιτρέπει την είσοδο του κυττάρου στη φάση S είναι η φωσφορυλίωση της πρωτεϊνης Rb που καταλύεται κύρια από τα σύμπλοκα CycD-Cdk4 και CycD-Cdk6 στo μέσο της φάσης G1 (βήμα ). Η φωσφορυλίωση αυτή έχει σαν αποτέλεσμα την αποδέσμευση της μεταγραφικής ενεργότητας των μεταγραφικών παραγόντων της οικογένειας E2F από την ανενεργή κατασταλμένη μορφή του συμπλόκου pRb-E2F. Ο E2F στη συνέχεια επάγει την παραγωγή των CycE και Cdk2 (βήμα ) και η δημιουργία του συμπλόκου CycΕ-Cdk2 καταλύει την περαιτέρω φωσφορυλίωση της pRb (βήμα ). Το γεγονός αυτό αποτελεί και το καθοριστικό βήμα για την προώθηση του κυτταρικού κύκλου πέρα από το σημείο ελέγχου R της G1S. Ο κυτταρικός κύκλος τώρα θα συνεχιστεί ακόμη και απουσία μιτογόνων. Η πρωτεϊνη Rb παραμένει φωσφορυλιωμένη στις φάσεις S, G2 και M από τα σύμπλοκα Cdk2-, Cdk1- με τις Cyc A, B, ενώ τελικά οι παράγοντες E2F αναστέλονται στη φάση M μέσω αποφωσφορυλίωσης της pRb από τη φωσφατάση PP-1 (βήμα ). Η αποφωσφορυλίωση της pRb επιτρέπει την πρόσδεση της στον E2F (βήμα ) επάγοντας έτσι την πλήρη καταστολή της μεταγραφικής του ενεργότητας μέχρι να εμφανιστούν και πάλι οι κατάλληλες συνθήκες για να ξεκινήσει ένας νέος κυτταρικός κύκλος. Για τη σύνθεση του DNA απαιτείται η CycA αφού κύτταρα θηλαστικών που φέρουν μεταλλαγμένη CycA χάνουν την ικανότητα να συνθέτουν DNA. Η σύνθεση της CycA αρχίζει όταν τα κύτταρα πλησιάζουν το σημείο μετάβασης G1S και συνοδεύεται με άμεση μετατόπιση της πρωτεϊνης στον πυρήνα. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι μέχρι σήμερα δεν έχει βρεθεί πoια πρωτεΐνη παίζει το ρόλο της Sic1 στα θηλαστικά η οποία αναλογικά θα δρα σαν αναστολέας (μέχρι να αποδομηθεί εντελώς κατά την έναρξη της φάσης S) του συμπλόκου CycA-Cdk2.

Απο-φωσφορυλίωση του pRb Μοριακά γεγονότα που απαιτούνται για την προώθηση του κυτταρικού κύκλου στο σημείο μετάπτωσης G1S μετά από ενεργοποίηση εισόδου στον κυτταρικό κύκλο παρουσία μιτογόνων Τα μιτογόνα μέσω διακριτών μονοπατιών μεταγωγής σήματος ενεργοποιούν τα σύμπλοκα κυκλινών-κινασών CycD-Cdk4, CycD-Cdk6 και CycΕ-Cdk2 τα οποία με τη σειρά τους φωσφορυλιώνουν την πρωτεϊνη pRb που έχει προσδέσει τους μεταγραφικούς παράγοντες της οικογένειας E2F (ή τις πρωτεϊνες p107, p130 που επίσης προσδένουν τους E2F παράγοντες) Η φωσφορυλίωση της pRb έχει σαν αποτέλεσμα την απελευθέρωση των μεταγραφικών παραγόντων E2F που ενεργοποιούν στη συνέχεια τα ίδια τους τα γονίδια (αυτορύθμιση), τις κυκλίνες και τις κυκλινο-εξαρτώμενες κινάσες που εμπλέκονται στη φωσφορυλίωση του pRb αλλά και μια σειρά άλλων γονιδίων που συμμετέχουν στο διπλασιασμό του DNA επιτρέποντας έτσι την προώθηση του κυτταρικού κύκλου στο σημείο G1S. Η αποφωσφορυλίωση του E2F (από τη φωσφατάση PP-1) κατά το τέλος της μίτωσης έχει σαν αποτέλεσμα την αναστολή της κυτταρικής αύξησης μέχρι να παρουσιαστεί και πάλι το κατάλληλο ερέθισμα (παρουσία μιτογόνων). Φωσφορυλίωση του pRb Αποδέσμευση του E2F M G2 S G1 Κυκλίνη D Cdk4/6 Rb E2F Κυκλίνη E Cdk2 Απο-φωσφορυλίωση του pRb πρόσδεση στον E2F Όμοια σε G0 κύτταρα ΜΙΤΟΓΟΝΑ ή p107, p130 PP-1     

Η κύρια Cdk κατά τη φάση G2 είναι η Cdk1 ενώ η είσοδος του κυττάρου στη μίτωση οφείλεται στην ενεργότητα MPF των συμπλόκων CycA-Cdk1 και CycB-Cdk1. Στα ανθρώπινα κύτταρα η CycΒ αρχικά συσσωρεύεται στο κυτταρόπλασμα και μετά εισέρχεται στον πυρήνα ακριβώς πριν τη κατάρρευση του στη πρώϊμη μίτωση. Ετσι η MPF ενεργότητα των συμπλόκων μπορεί να ελέγχεται όχι μόνο μέσω φωσφορυλίωσης-αποφωσφορυλίωσης αλλά και από το χρονισμό της εισόδου στον πυρήνα. Γενικά στα ανθρώπινα κύτταρα η είσοδος στη μίτωση ρυθμίζεται από μια σειρά από φωσφορυλιώσεις-αποφωσφορυλιώσεις των συμπλεγμάτων Cdk1-CycA και Cdk1-CycΒ (πιθανώς στις φάσεις αυτές εμπλέκεται και η Cdk2). H πρόσδεση της Cdk1 στις CycΑ, Β και οι συνεπακόλουθες φωσφορυλιώσεις (Wee1, CAK) και αποφωσφορυλιώσεις (Cdc25) ρυθμίζουν τη μετάβαση G2Μ αφού δομικές μελέτες στις ανθρώπινες πρωτεϊνες έδειξαν ότι η πρόσδεση της CycA στη Cdk1 και η τελική φωσφορυλίωση της Thr161 προκαλούν μια σειρά από αλλαγές διαμόρφωσης που εκθέτουν το ενεργό κέντρο και τροποποιούν την επιφάνεια πρόσδεσης έτσι ώστε να εμφανίζει υψηλή συγγένεια για τα διάφορα υποστρώματα. Επιπλέον η κατευθυνόμενη μέσω APC (προωθεί την πρωτεόλυση μιτωτικών κυκλινών) πολυ-ουμπικιτινίωση των CycΑ και CycΒ και η αποδόμηση τους στα πρωτεοσώματα (αρχικά της CycΑ κατά την μετάφαση, που ακολουθείται από την αποδόμηση της CycΒ) προκαλεί μια γρήγορη πτωση της ενεργότητας MPF επιτρέποντας την ολοκλήρωση της μίτωσης και την είσοδο του κυττάρου στον επόμενο κύκλο. Η αποδόμηση της Cyc-A και η γενική πτώση της συγκέντρωσης των Cyc και Cdk προς το τέλος της M ή στην πρώϊμη G1 (ή ακόμη αν τα κύτταρα εισέλθουν στη φάση G0) συμπίπτει με την αποφωσφορυλίωση της pRb. Ετσι τα κύτταρα βγαίνουν από τη φάση Μ χωρίς μιτωτικές κυκλίνες (Α, Β) οι οποίες αν και στη συνέχεια συντίθενται και προσδένονται στη Cdk1 η πρόσδεση τους αυτή δεν αρκεί για να επάγει την ενεργοποίηση του συμπλόκου. Γενικά είναι φανερό ότι η ρύθμιση των ενδοκυττάριων επιπέδων των κυκλινών γίνεται είτε μεσω της μεταγραφικής τους ρύθμισης είτε μέσω πρωτεολύσης του αναστολέα τους είτε τέλος μέσω πρωτεόλυσης της ίδιας της κυκλίνης.

Η ενεργότητα της κινάσης της φάσης της μίτωσης (MPK ή MPF) (σύμπλοκο CycA ή B-Cdk1) ρυθμίζεται στα θηλαστικά (όπως και στον σακχαρομύκητα) μέσω φωσφορυλιώσεων (κινάσες Wee1, CAK) και αποφωσφορυριώσεων (φωσφατάση Cdc25) της Cdk1 και πρωτεϊνικής αποδόμησης των κυκλινών Α, Β κατά το τέλος της μίτωσης. Οι κινάσες που ενεργοποιούν το σύμπλοκο είναι αντίστοιχες με αυτές που έχουν βρεθεί στους μύκητες. Τα αμινοξέα που φωσφορυλιώνονται στην Cdk2 είναι η Tyr15 και η Thr161. Ο σχετικό χρονισμός για κάθε γεγονός δεν είναι ακόμη απόλυτα γνωστός. Ενεργοποίηση πρόσδεση υποστρώματος Κινάση CAK MFP Φωσφορυλίωση κινάσης Tyr15 Thr161 Φωσφατάση Cdc25 Απο-φωσφορυλίωση κινάσης Cdk1 Cdk1 Cdk1 Cyc-A,B Cyc-A,B Cyc-A,B ΑΝΕΝΕΡΓΗ ΑΝΕΝΕΡΓΗ Αυτο-φωσφορυλίωση κυκλίνης ΕΝΕΡΓΗ Φωσφορυλίωση κινάσης Αποδόμησηση κυκλίνης Κινάση Wee1 APC Αποφωσφορυλίωση κινάσης Rb Cdk1 Cdk1 Cdk1 Cyc-A,B Σύνδεση Κυκλίνης- Κινάσης Cyc-A,B Σύνθεση Κυκλίνης Cyc-A,B

Η καταστολή της ενεργότητας των συμπλόκων Cyc-Cdk (ενεργότητα κινάσης) και κατ΄ επέκταση η περαιτέρω ρύθμιση της εξέλιξης του κυτταρικού κύκλου επιτυγχάνεται μέσω αρνητικών ρυθμιστών στους οποίους περιλαμβάνονται ομάδες πρωτεϊνών μικρού (συνήθως) μοριακού βάρους που ονομάζονται αναστολείς Cdk (CdkI, Cdk Inhibitors). Οι ειδκοί αυτοί αναστολείς δρούν είτε μπλοκάροντας την ενεργοποίηση της Cdk κινάσης (λόγω πρόσδεσης τους στη Cyc), είτε παρεμποδίζοντας την πρόσβαση του υποστρώματος στόχου ή του ATP στο σύμπλοκο Cyc-Cdk. Οι CdkIs αποτελούν μέρος των μηχανισμών ανάδρασης των κυττάρων που ελέγχουν τα κατάσταση των γεγονότων που λαμβάνουν χώρα κατά τον κυτταρικό, κύκλο όπως η αντιγραφή του DNA ή η συμπύκνωση των χρωμοσωμάτων. Η “ανάλυση” της πληροφορία αυτής στη συνέχεια καθορίζει αν ο κυτταρικός κύκλος θα συνεχιστεί. Κατά αυτήν την έννοια τα σημεία G1S και G2M είναι ζωτικής σημασίας όσον αφορά τους πρωταρχικούς ελέγχους των μηχανισμών ανάδρασης και αφορούν τη “δέσμευση” (που λαμβάνει χώρα κατά τη φάση G1) για τον διπλασιασμό των χρωμοσωμάτων και τη “δέσμευση” (που συμβαίνει στο τέλος της φάσης G2) για την είσοδο στη μίτωση (δευτερεύων σημείο ελέγχου). Αν ένα κύτταρο εκτεθεί σε παράγοντες που προκαλουν βλάβες στο DNA το πέρασμα από το σημείο G1-S καθυστερεί μέχρι να διορθωθεί η βλάβη, ενώ αν διαπιστωθεί μη σωστός σχηματισμός της μιτωτικής ατράκτου ο κύκλος διακόπτεται κατά την ανάφαση.

Αναστολή ενεργότητας κινασών Η επιτυγχάνεται μέσω καταστολής της ενεργότητας κινάσης των συμπλόκων Cyc-Cdk. Μεταξύ των αρνητικών ρυθμιστών περιλαμβάνεται μια ομάδα από μικρού μοριακού βάρους πρωτεΐνες που ονομάζονται αναστολείς Cdk (CdkI, Cdk Inhibitors). Οι αναστολείς αυτοί δρουν είτε μπλοκάροντας την ενεργοποίηση της Cdk κινάσης (λόγω φυσικής τους αλληλεπίδρασης με την Cyc), είτε μπλοκάροντας την πρόσβαση του υποστρώματος στόχου ή του ATP στο σύμπλοκο Cyc-Cdk. Αναστολή ενεργότητας κινασών  Επαγωγέας ΑΝΑΣΤΟΛΗ της ενεργότητας κινάσης Aναστολέας Cdk (CdkI) ΑΝΑΣΤΟΛΗ κυτταρικού κύκλου

Οι CdkIs ομαδοποιούνται σε δύο οικογένειες: (1) Την οικογένεια ΙΝΚ4 (inhibitors of kinase 4) που αποτελείται από τέσσερα μέλη και ειδικότερα τις πρωτεϊνες p16Ink4a, p15Ink4b, p18Ink4c και p19Ink4d. (ή p14ARF το ανθρώπινο ομόλογο γονίδιο) που αναστέλουν ειδικά τα σύμπλοκα CycD-Cdk4, CycD-Cdk6. (2) Την οικογένεια Cip/Kip που αποτελείται από τρία μέλη. Την p21Cip1, την p27Kip1 και την p57Kip2. Οι πρωτεΐνες αυτές αναστέλουν ισχυρά τα σύμπλοκα των Cdk2-CycE και Cdk2-CycA κινασών ενώ παρότι έχει βρεθεί ότι τα σύμπλοκα CycD-Cdk όχι μόνο δεν επηρεάζονται αλλά και απαιτούν τις Cip/Kip πρωτεϊνες για σωστή αυτοσυγκρότηση δεν μπορεί να αποκλειστεί ότι κάτω από συγκεκρίμενες συνθήκες οι Cip/Kip πρωτεϊνες μπορούν να αναστείλουν την ενεργότητα και των Cdk4-6/CycD.

Αυτοσυγκρότηση και ενεργότητα των Cdk-Cyc συμπλόκων Cip /Kip Κυκλίνη D Cdk4/6 Rb E2F Κυκλίνη E Cdk2 Είσοδoς στη φάση S ΜΙΤΟΓΟΝΑ Ενεργό σύμπλοκο Φωσφορυλίωση Rb Θετική ανάδραση Ανενεργό σύμπλοκο Φωσφορυλίωση Cdk και αποδόμηση Ενεργοποίηση Ε-K2 Πρόσδεση CKI

Αυτοσυγκρότηση και ενεργότητα των Cdk-Cyc συμπλόκων Cip /Kip Κυκλίνη D Cdk4/6 ΜΙΤΟΓΟΝΑ Ενεργό σύμπλοκο ~ 150 kDa Αυτοσυγκρότηση Σύνθεση Ανενεργό σύμπλοκο ~ 50 kDa Χαπερόνη ~ 450 kDa INK4 Cdk2 Κυκλίνη E

ΑΝΑΣΤΟΛΗ αυτοσυγκρότησης και ενεργότητας των Cdk4/6-CycD συμπλόκων Χ M G2 S G1 Rb E2F Απο-φωσφορυλίωση του pRb πρόσδεση στον E2F Κυκλίνη D Cdk4/6 p16 ΜΙΤΟΓΟΝΑ Cdk2 p21 Cdk 2 p27 Κυκλίνη E Κυκλίνη A

G1 και S Φάσεις του Κυτταρικού κύκλου

G2 και M Φάσεις του Κυτταρικού κύκλου

σινιάλα από μιτογόνους αναπτυξιακούς παράγοντες Η ανακοπή του κυτταρικού κύκλου σε κάποιο από τα σημεία ελέγχου συνδέεται με τη σύνθεση των CdkIs η οποία ενεργοποιείται ειδκά μέσω ειδικών μονοπατιών μεταγωγής σήματος που εντοπίζουν τις εν λόγω βλάβες. p53 Bax MDM2 p21 Cdk-Cyc, PCNA GADD45 προσδένεται στο PCNA επιδιόρθωση DNA Cyclin G άγνωστη λειτουργία IGF-BP3 απόπτωση σινιάλα από μιτογόνους αναπτυξιακούς παράγοντες Βλάβη στο DNA ATM p14ARF Τα πιο πολλά τέτοια μονοπάτια μεταγωγής σήματος ελέγχονται από την πρωτεΐνη p53 (τον «φύλακα του γονιδιώματοσ»)

Δομής της πρωτεΐνης p53 αποδόμηση p53 αναστολή έκφρασης p21 Ν C I II IV V Πρόσδεση SV40T E6, E1b MDM2 Θέση τετραμερισμού Θέση ενεργοποίησης μεταγραφής Περιοχή πρόσδεσης στο DNA μη-εξαρτώμενη από την ακολουθία εξαρτώμενη από την ακολουθία στόχο Mdm2 αποδόμηση p53 αναστολή έκφρασης p21

Δομής της πρωτεΐνης p53

Ρύθμισης της σταθερότητας και τοπολογίας της πρωτεΐνης p53 Mdm2 p53 αποδόμηση του p53 από το 26S πρωτεόσωμα πυρηνίσκος πυρήνας  

Το μονοπάτι σηματοδότησης του p53

Ρύθμιση σηματοδοτικών μονοπατιών από το p53 και φαινοτυπικό αποτέλεσμα ΑΝΑΣΤΟΛΗ κυτταρικού Κύκλου - S Ανεξάρτητα του pRb p53 PCNA

Τα μονοπάτια σηματοδότησης του p53 και Rb (p14ARF) p19ARF INK4A/ARF p16INK4A Mdm2 p53 pRB σιγή E2F Cdks4/6 Cyclin D ? p21 ΑΤΜ Αναστολή Κυτταρικού Κύκλου-Γήρανση Bmi-1 Απόπτωση p27kip1 PIP3-μείωση PI3K Onco-Ras Raf, Mek Μειωμένη πολλαπλασιαστική ικανότητα Shc PTEN Συσσώρευση Κυτταρικών διαιρέσεων ? PCNA Cdk2 Cyclins E/A Τα μονοπάτια σηματοδότησης του p53 και Rb

Τα μονοπάτια σηματοδότησης του p53 και Rb

ΜΙΤΩΣΗ & ΚΥΤΤΑΡΟΚΙΝΗΣΗ Φωτογραφία φθορισμού ανθρωπίνων κυττάρων κατά τη διάρκεια διαφόρων φάσεων του κυτταρικού κύκλου. Σε ορισμένα κύτταρα σε φάση μίτωσης (βέλος) διακρίνεται η μιτωτική άτρακτος (με πράσινο χρώμα) μετά από ανοσοσήμανση με ένα μονοκλωνικό αντίσωμα για τουμπουλίνη και τα χρωμοσώματα (μπλε χρώμα) λόγω χρώσης με μια φθορίζουσα χρωστική που προσδένεται στο DNA. Το όνομα μίτωση (mitosis) προέρχεται από τη λέξη “μίτος” που σημαίνει νήμα και πρωτοχρησιμοποιήθηκε το 1870 για να περιγράψει τα νηματοειδή χρωμοσώματα που παρατηρούνται στο κύτταρο λίγο πριν αυτό διαιρεθεί. Η διαδικασία της μίτωσης χωρίζεται σε 5 στάδια (πρόφαση, προμετάφαση, μετάφαση, ανάφαση και τελόφαση) καθένα από τα οποία χαρακτηρίζεται από μια συγκεκριμένη ακολουθία γεγονότων. Η όλη διαδικασία είναι συνεχής και ότι η διάκριση σε επιμέρους στάδια αφορά λόγους κατανόησης και πειραματισμού.

τελόφαση κυττοκίνηση μεσόφαση πρόφαση προ-μετάφαση μετάφαση ανάφαση Οι φάσεις της μίτωσης Πρόφαση. 1. Το χρωμοσωμικό υλικό συμπυκνώνεται προκειμένου να δημιουργηθούν συμπαγή μιτωτικά χρωμοσώματα. 2. Τα χρωμοσώματα που τώρα αποτελούνται από δύο χρωματίδες παραμένουν ενωμένα μέσω του κεντρομεριδίου. 3. Συγκρότηση μιτωτικής ατράκτου. 4. Εξαφάνιση του κυτταροσκελετού και της πυρηνικής μεμβράνης. Το σύμπλεγμα Gogli και το ενδοπλασματικό δίκτυο (ER) κατακερματίζονται. Προμετάφαση. 1. Οι μικροσωληνίσκοι των χρωμοσωμάτων προσδένονται στους κινετοχώρους των χρωμοσωμάτων. 2. Τα χρωμοσώματα μετακινούνται προς τον ισημερινό της ατράκτου. Μετάφαση. 1. Τα χρωμοσώματα ευθυγραμμίζονται γύρω από το επίπεδο (ή πλάκα) της μετάφασης ενώ παραμένουν προσδεμένα μέσω των χρωμοσωμικών μικροσωληνίσκων και στους δύο πόλους. Ανάφαση. 1. Τα κεντρομερίδια διαιρούνται και οι χρωματίδες διαχωρίζονται. 2. Τα χρωμοσώματα κινούνται προς τους αντίθετους πόλους της ατράκτου. 3. Οι πόλοι της ατράκτου απομακρύνονται περαιτέρω. Τελόφαση. 1. Τα χρωμοσώματα ομαδοποιούνται στους αντίθετους πόλους της ατράκτου. 2. Τα χρωμοσώματα απο-συμπυκνώνονται. 3. Σχηματισμός πυρηνικού φακέλου γύρω από τις ομάδες των χρωμοσωμάτων. 4. Επανασχηματισμός Golgi και ER. 5. Κυττοκίνηση

ΠΡΟΦΑΣΗ Κατά την πρώτη φάση της μίτωσης, αυτή της πρόφασης, τα διπλασιασμένα χρωμοσώματα ετοιμάζονται για να διαχωριστούν ενώ παράλληλα πραγματοποιείται και η αυτοσυγκρότηση της μιτωτικής μηχανής. α. Δημιουργία του μιτωτικού χρωμοσώματος: Κατά τη μεσόφαση το DNA στον πυρήνα είναι σε μορφή ινών χρωματίνης που είναι εξαιρετικά εκτεταμένες και οι οποίες διευκολύνουν τις διαδικασίες της αντιγραφής και μεταγραφής αλλά δεν μπορούν να υποβοηθήσουν το διαχωρισμό των χρωμοσωμάτων. Για το λόγο αυτό θα πρέπει οι ίνες χρωματίνης να συμπυκνωθούν σε πιο κοντά και χοντρά ινίδια τα οποία γίνονται ορατά στην πρώιμη πρόφαση. Οι κυλινδρικοί σχηματισμοί που παρατηρούνται κατά την πρόφαση να απαρτίζουν κάθε χρωμόσωμα με συμμετρική κατά μήκος τοποθέτηση ονομάζονται χρωματίδες. Οι χρωματίδες είναι πανομοιότυπα αντίγραφα του DNA που διπλασιάστηκε κατά τη φάση S και συγκρατούνται μεταξύ τους στα κεντρομερίδια και πιό χαλαρά σε όλο τους το μήκος. Η χρωματίνη ενός κύτταρου στη μεσόφαση οργανώνεται σε ινίδια διαμέτρου περίπου 30 nm. Παρόμοιο μέγεθος βρισκεται και στη χρωματίνη των χρωμοσωμάτων γεγονός που σημαίνει ότι η όλη διαδικασία μορφογένεσης των χρωμοσωμάτων αφορά κυρίως διαφορετικό τρόπο στο πακετάρισμα της χρωματίνης. β. Κεντρομερίδιο και κινετοχώρος: Το κεντρομερίδιο είναι ένα σημείο πρωτογενούς σύσφιξης που αποτελείται από επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες στο DNA πάνω στις οποίες προσδένονται διάφορες πρωτεϊνες. Ο κινετοχώρος είναι μια επίπεδη δομή που βρίσκεται στην εξωτερική επιφάνεια του κεντρομεριδίου και χρησιμεύει σαν το σημείο πρόσδεσης των χρωμοσωμάτων στους μικροσωληνίσκους της μιτωτικής ατράκτου. Επίσης είναι το σημείο όπου προσδέονται πολλές από τις πρωτεϊνες κίνησης (motor proteins). Οι παρατηρήσεις αυτές υποδεικνύουν ότι ο κινετοχώρος παίζει πιθανότατα ρόλο στη μετακίνηση των χρωμοσωμάτων κατά τη μίτωση.

γ. Δημιουργία της μιτωτικής ατράκτου: Οι μικροσωληνίσκοι του κυτταροσκελετού οργανώνονται από το κεντρόσωμα . Καθώς το κύτταρο προχωρά προς το τέλος της φάσης G2 και τη μίτωση οι μικροσωληνίσκοι του κυτταροσκελετού αποδιοργανώνονται καθώς “προετοιμάζονται” για την επανα-αυτοσυγκρότηση τους προκειμένου να δημιουργηθούν τα συστατικά της μιτωτικής ατράκτου. Προκειμένου δε να γίνει κατανοητός ο σχηματισμός της μιτωτικής ατράκτου είναι απαραίτητο να αναλύσουμε τον κύκλο του κεντροσώματος σε σχέση με τον κυτταρικό κύκλο. Οταν ένα κύτταρο εξέρχεται από τη μίτωση περιέχει ένα μόνο κεντρόσωμα το οποίο περιέχει δύο κεντρίδια τα οποία είναι τοποθετημένα με δεδομένη γωνία μεταξύ τους. Ο κύκλος του κεντροσωματίου αρχίζει στη φάση G1 όταν τα κεντρίδια (ή κεντριόλια) και τα άλλα συστατικά του χρωμοσώματος διπλασιάζονται. Καθώς τα χρωμοσώματα διπλασιάζονται κατά τη φάση S το ζευγάρι των κεντριολίων διπλασιάζεται επίσης (στο κυτταρόπλασμα) και κάθε καινούργιο ζεύγος τοποθετείται σε συγκεκριμένη γωνία σε σχέση με το μητρικό. Το νέο κεντριόλιο ωριμαζει καθώς επιμηκύνονται οι μικροσωληνίσκοι από αυτό, ενώ αξίζει να αναφέρουμε ότι το μητρικό κεντριόλιο δε συνδέεται με το κεντρίολιο απόγονος. Στη G2 και νωρίς κατά την έναρξη της μίτωσης τα δυο κεντριόλια έχουν φτάσει το πλήρες μέγεθος τους αλλά παραμένουν ακόμη στο ίδιο κεντρόσωμα. Το πρώτο στάδιο στο σχηματισμό της μιτωτικής ατράκτου σε ένα τυπικό ζωϊκό κύτταρο είναι η εμφάνιση των μικροσωληνίσκων σε μια μορφη ηλιαχτίδων ή “αστεριού” (αστεροειδείς μικροσωληνίσκοι) γύρω από κάθε κεντρόσωμα κατά τη διάρκεια της πρώιμης πρόφασης.

Λειτουργικά οι μικροσωληνίσκοι της μιτωτικής ατράκτου μπορούν να διακριθούν σε 3 ομάδες όλες από τις οποίες έχουν την ίδια πολικότητα. (1) Αστεροειδείς μικροσωληνίσκοι. Εξέρχονται σε ακτινωτή διάταξη από το κεντρόσωμα στην περιοχή εκτός του κυρίως τμήματος της ατράκτου. Πιθανότατα βοηθούν την τοποθέτηση της ατράκτου στο κύτταρο και καθορίζουν το επίπεδο της κυττοκίνησης. (2) Χρωμοσωμικοί (ή κινετοχωρικοί) μικροσωληνίσκοι. Εξέρχονται από το κεντρόσωμα προς τους κινετοχώρους των χρωμοσωμάτων και χρησιμεύουν στην μετακίνηση των χρωμοσωμάτων προς τους πόλους κατά την ανάφαση. (3) Πολικοί (ή διαπολικοί) μικροσωληνίσκοι. Εξέρχονται από το κεντροσωμάτιο αλλά δεν συνδέονται με χρωμοσώματα. Διαμορφώνουν ένα δομικό καλάθι το οποίο διατηρεί την ακεραιότητα της ατράκτου. Κανένας πολικός μικροσωληνίσκος δεν εκτείνεται έως τον άλλο πόλο αλλά ενώνεται περίπου στο μέσο της ατράκτου με τους πολικούς μικροσωληνίσκους που προέρχονται από τον άλλο πόλο. Παρατήρηση στο ΗΜ δείχνει ότι οι αστεροειδείς μικροσωληνίσκοι δεν είναι σε επαφή με τους χρωμοσωμικούς μικροσωληνίσκους και προέρχονται από το υλικό πέριξ των κεντριολίων που δρα σαν χώρος έναρξης πολυμερισμού των μικροσωληνίσκων των οποίων τα + άκρα είναι μακριά από το κεντρόσωμα. Η διαδικασία δημιουργίας του αστεριού ακολουθείται από τη διαίρεση των κεντροσωμάτων και τη μετανάστευση τους σε αντίθετα άκρα του κύττάρου. Κατά τη μετανάστευση αυτή οι μικροσωληνίσκοι τεντώνονται αυξάνουν σε αριθμό και επιμηκύνονται. Τελικά τα δύο κεντροσώματα φτάνουν στα δύο άκρα αντίθετα το ένα από το άλλο και εγκαθιδρύουν τους δύο πόλους της μιτωτικής ατράκτου. Μετά τη μίτωση κάθε κεντρόσωμα κληρονομείται σε ένα κύτταρο. Θα πρέπει να επισημανθεί ότι τα κεντριόλια δε φαίνεται να είναι απαραίτητα στοιχεία για το σχηματισμό της μιτωτικής ατράκτου αφού ένας αριθμός ζωϊκών και φυτικών (ανώτερα φυτά) κυττάρων δεν έχουν κεντριόλια.

δ. Κατάρευση του πυρηνικού φακέλου και κατακερματισμός των κυτταροπλασμικών οργανιδίων: Η κατάρευση του πυρηνικού φακέλου είναι ένα από τα πιό κατανοητά φαινόμενα της μίτωσης. Ανάμεσα στα υποστρώματα των Cdk που ενεργοποιούνται στο τέλος της φάσης G2 είναι οι πυρηνικές λαμίνες που αποτελούν τα κύρια συστατικά της εσωτερικής πλευράς του πυρηνικού φακέλου. Η φωσφορυλίωση των μορίων αυτών (λαμίνες) από τις Cdk προωθεί την αποδιοργάνωση των ινιδίων που σχηματίζουν την πυρηνική λαμίνα. Οι πυρηνικές μεμβράνες αρχικά κερματίζονται σε επίπεδα σακοειδή κυστίδια που περιβάλλουν τη συμπηκνούμενη χρωματίνη και τελικά σε ένα πληθυσμό από μικρά κυστίδια (70 nm). Κάποια από τα οργανίδια παραμένουν άθικτά κατά τη μίτωση (μιτοχόνδρια, περοξεισώματα, λυσοσώματα, υπεροξυσώματα και οι χλωροπλάστες των φυτικών κυττάρων ενώ κάποια άλλα όπως το ER ή το Golgi κατακερματίζονται και σχηματίζουν μικρά κυστίδια που απλώνονται στο κυτταρόπλασμα διευκόλυντας έτσι το μοίρασμα των μεμβρανικών αυτών συστημάτων στα δύο κύτταρα απογόνους.

Οι φάσεις της μίτωσης στο ζωϊκό κύτταρο Τελόφαση-Κυτταροκίνηση Ανάφαση Μετάφαση Πρόφαση Μεσόφαση

ΠΡΟΜΕΤΑΦΑΣΗ Η κατάρευση του πυρηνικού φακέλου σηματοδοτεί την έναρξη της επόμενης φάσης της μίτωσης που είναι η προμετάφαση κατά την οποία σχηματίζεται η τελική μιτωτική άτρακτος και τα χρωμοσώματα μετακινουνται στην τελική τους θέση στο κέντρο του κυττάρου. Στην αρχή της προμετάφασης τα χρωμοσώματα είναι διασκορπισμένα σε όλο τον χώρο όπου πριν ήταν η περιοχή του πυρήνα. Καθώς όμως οι μικροσωληνίσκοι εισβάλλουν στον χώρο αυτό τα ελεύθερα άκρα μερικών από τους μικροσωληνίσκους (θετικά άκρα) συλλαμβάνονται από τον κινετοχώρο. Το άκρο του μικροσωληνίσκου εισχωρεί εντός του κινετοχώρου και έτσι προσδένεται ισχυρά πάνω στο χρωμόσωμα. Στις περιπτώσεις όπου ένας κινετοχώρος προσδεθεί σε μικροσωληνίσκους από αντίθετους πόλους τότε η μια πρόσδεση χαλαρώνει και τελικά αποσυνδέεται. Τελικά μέσω της διαδικασίας αυτής κάθε χρωματίδα ενός χρωμοσώματος είναι συνδεδεμένη μέσω του κινετοχώρου και μέσω μικροσωληνίσκων με τους δύο αντίδιαμετρικά τοποθετημένους πόλους. Τα χρωμοσώματα δεν κινούνται κατευθείαν προς το κέντρο του κυττάρου αλλά ταλαντεύονται μπρος και πίσω. Ανάλυση όμως των δυνάμεων που ασκούνται σε κάθε χρωμόσωμα έδειξε ότι ασκείται μεγαλύτερη τάση από τον μακρύτερο μικροσωληνίσκο και έτσι το χρωμόσωμα μετακινείται προς τον πόλο από τον οποίο εκφύεται ο μικροσωληνίσκος αυτός.

ΜΕΤΑΦΑΣΗ Απο τη στιγμή που τα χρωμοσώματα έχουν ευθυγραμιστεί τον ισημερινό της μιτωτικής ατράκτου με την μία χρωματίδα να “βλέπει” τον ένα πόλο και την άλλη τον άλλο, το κύτταρο έχει φτάσει στο στάδιο της μετάφασης. Το επίπεδο ευθυγράμμισης των χρωμοσωμάτων ονομάζεται μεταφασική πλάκα. Παρότι δε φαινομενικά κατά τη μετάφαση δεν παρατηρείται ιδιαίτερη κινητικότητα, η φάση αυτή χαρακτηρίζεται από έντονη ενεργητικοτητα αφού για παράδειγμα ένα από τα κύρια σημεία ελέγχου του κυτταρικού κύκλου βρίσκεται εδώ. Αν για παράδειγμα μετακινηθεί με μια μικροβελόνα ένα χρωμόσωμα από τη θέση του το κύτταρο καθυστερεί στο συγκεκριμένο στάδιο μέχρι το χρωμόσωμα να τοποθετηθεί και πάλι στη θέση του. Φαίνεται λοιπόν ότι τα χρωμοσώματα τα οποία δεν είναι κανονικά τοποθετημένα στη θέση τους ελευθερώνουν ένα σινιάλο που μπλοκάρει την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου. Το σινιάλο αυτό θα πρέπει να σχετίζεται πιθανότατα με ενεργότητα Cdk όπως συμβαίνει και στα σημεία ελέγχου G1S και G2Μ. H ιδέα της «σύσπασης» για την κίνηση των χρωματοσωμάτων κατά τη μίτωση προτάθηκε οπό τον Flemming στο 1879. Στα 1952, έγινε κατορθωτό οπό τους Μazia και Dan να απομονωθεi «μιτωτική συσκευή» και να δειχτεi έτσι πως αποτελεί ξεχωριστή δομική οντότητα ικανή να παρατηρηθεi με πολωτικό μικροσκόπιο. Αργότερα βρέθηκε πως η ιδιότητα αυτή οφείλεται στην ινώδη, παράλληλη μορφή των μικροσωληνίσκων που έτσι εμφανίζουν διπλοθλαστικότητα, η οποία μπορεί πειραματικά να ελαττωθεί με χαμηλή θερμοκρασία (σήμερα ξέρουμε ότι έτσι αποπολυμερίζονται οι μικροσωληνίσκοι) ή με αντιμιτωτικές ουσίες όπως η κολχικίνη (είναι γνωστό πως η αλκαλοειδής αυτή ουσία δεσμεύεται στα μονομερή τουμπουλίνης εμποδίζοντας έτσι τον πολυμερισμό τους). H σύνδεση των μικροσωληνiσκων με τα χρωμοσώματα κατά τη μίτωση, είναι εμφανής αλλά πειστική απόδειξη για τη συμμετοχή τους στην άτρακτο έχει δοθεi με ανοσοφθορισμό. Aντίθετα, οι μικροσωληνίσκοι θεωρούνται ως τα κατ’ εξοχήν ινίδια που συμμετέχουν στην κίνηση των χρωμοσωμάτων.

ΜΕΤΑΦΑΣΗ Ο αριθμός των μικροσωληνίσκων κατά τη μίτωση είναι 2.500 για τα πιο πολλά ζωικά κύτταρα, αλλά μπορεί να φτάσει και μέχρι 4.000 σε φυτικά κύτταρα (π.χ. ενδοσπέρμιο Haemanthus). Με τη βοήθεια μικρομεθόδων και ιδιαίτερα του πιεζοηλεκτρικού μικροχειριστή αν κατά την ανάφαση σπρώξουμε ένα χρωμόσωμα προς τους πόλους και το αφήσουμε σε κάποια θέση, αυτό θα μείνει προσωρινά εκεί, αλλά θα προχωρήσει στη συνέχεια προς τον αντίστοιχο πόλο μόνο σε συγχρονισμό με τα άλλα χρωμοσώματα που έχουν μείνει πιο πίσω. Παρόμοια πειράματα δίνουν την εντύπωση πως κάθε χρωμόσωμα έχει ανεξάρτητο μηχανισμό κίνησης προς τους πόλους της ατράκτου αλλά υπάρχει ταυτόχρονα και ένας κοινός, για όλα τα χρωμοσώματα, μηχανισμός. Aκόμα αν τραβηχτεί ένα χρωμόσωμα ώστε να σπάσει στον κινητοχώρο τότε το χρωμόσωμα έχει την ικανότητα να ξανασυνδέσει τον κινητοχώρο του με νέους μικροσωληνίσμους που μπορεί και να το οδηγήσουν στον άλλο πόλο.

Ηλεκτρονιογραφία (αριστερά) και διαγραμματική απεικόνιση (δεξιά) της οργάνωσης των χρωμοσωμάτων στις θέσεις των κεντρομεριδίων. Διακρίνονται μικροσωληνίσκοι (ΜΣ). Ολόκληρα χρωμοσώματα (καρυότυπος) με κανονικες συνθήκες παρατήρησης (αριστερά) και μετά από ανοσοφθορισμό με αντίσωμα κεντρομεριδίων (δεξιά). Διακρίνονται ακροκεντρικά, τελοκεντρικά και μετακεντρικά χρωμοσώματα.

κινετοχώρος μικροσωληνίσκος εσωτερικό επίπεδο εξωτερικό επίπεδο (προσδένει τους χρωμοσωμικούς μικροσωληνίσκους) ινώδης περιοχή (περιέχει πρωτεΐνες κίνησης) Ετεροχρωματίνη κεντρομεριδίου Κινετοχώρος Περιέχει ένα ηλεκτρονιόπυκνο εξωτερικό και εσωτερικό επίπεδο (ή πλάκα). Η εξωτερική πλάκα περιέχει ινώδες υλικό που πιστεύεται ότι προσδένεται στις πρωτεΐνες κίνησης που συμμετέχουν στην κίνηση των χρωμοσωμάτων, ενώ η εσωτερική πλάκα προσδένεται στο τμήμα της κεντρομερικής χρωματίνης του χρωμοσώματος.

κεντριόλιο αστεροειδείς μικροσωληνίσκοι πολικοί υλικό που περιβάλλει το κεντριόλιο χρωμοσώματα χρωμοσωμικοί Διαγραμματική απεικόνιση της μιτωτικής ατράκτου των ζωϊκών κυττάρων. Κάθε πόλος περιέχει ένα ζεύγος κεντριολίων που περιβάλλεται από άμορφο υλικό στο οποίο ξεκινά η πυρηνοποίηση των μιρκοσωληνίσκων. Οι τύποι των ινιδίων της ατράκτου (μικροσωληνίσκοι) είναι τρεις. Τα αστεροειδή ινίδια, τα πολικά ινίδια και τα ινίδια που προσδένονται στους κινετοχώρους των χρωμοσωμάτων (χρωμοσωμικά ινίδια). Μιτωτική άτρακτος με χρωμοσώματα και δέσμη μικροσωληνίσκων όπως φαίνονται με ειδική χρώση (μετά από απομόνωση) με ιωδιούχο προπίδιο (propidium iodine)

ΑΝΑΦΑΣΗ Η ανάφαση αρχίζει με τον αποχωρισμό των αδερφών χρωματίδων που συνοδεύεται από ελευθέρωση στο κυτταρόπλασμα των πρωτεϊνών που κρατούν ενωμένες τις χρωματίδες. Πιθανώς η φάση αυτή ενεργοποιείται λόγω διακοπής ενεργότητας της Cdk που σχετίζεται με τη γρήγορη αποδόμηση της αντίστοιχης κυκλίνης. Καθώς δε δεν είναι πλέον προσδεδεμένα στις αδερφές χρωματίδες μετακινούνται προς τους αντίθετους πόλους λόγω μείωσης του μήκους των μικροσωληνίσκων που συνοδεύεται με απώλεια υπομονάδων μικροσωληνίσκων στη θέση του κινετοχώρου. Κατά την κίνηση αυτή προπορεύεται το κεντρόσωμα και ακολουθούν οι αρμοί των χρωμοσωμάτων. Το στάδιο αυτό ονομάζεται Ανάφαση Α προκειμένου να γίνεται διάκριση από την Ανάφαση Β κατά την οποία λαμβάνει χώρα παράλληλα η περαιτέρω απομάκρυνση των δύο πόλων της ατράκτου. Η κίνηση των χρωμοσωμάτων είναι πολύ αργή με ρυθμό 1μm ανά λεπτό και διαρκεί κάπου μεταξύ 2 και 60 λεπτών.

Αρχικά τα χρωμοσώματα προσδένονται μέσω του κινετοχώρου σε μικροσωληνίσκους που διαφέρουν σημαντικά όσον αφορά το μέγεθος τους. Καθώς η προμετάφαση συνεχίζεται η ανισορροπία αυτή διορθώνεται λόγω πρόσθεσης τουμπουλίνης στο κινετοχώρο του μικρού σε μήκους μικροσωληνίσκου και επιμήκυνση του που συνοδεύεται από αποπολυμερισμό στον κινετοχώτο του μεγάλου σε μήκος μικροσωληνίσκου (ενώ παράλληλα και στους δύο πόλους παρατηρείται αργός απόπολυμερισμός). Σαν αποτέλεσμα το χρώμοσωμα μετακινείται προς την μεταφασική πλάκα μέχρι του σημείου όπου το μήκος των μικροσωληνίσκων θα είναι παρόμοιο (επίπεδο μεσοφασικής πλάκας) και οι αντίρροπες δυνάμεις θα εξισορροπηθούν. Η ρόλος των μικροσωληνίσκων κατά τη μετακίνηση των χρωμοσωμάτων και τη δημιουργία της μεταφασικής πλάκας Πόλος κινετοχώρος μικροσωληνίσκος αργός αποπολυμερισμός πολυμερισμός γρήγορος

Οι λειτουργίες τους μπορούν να διακριθούν σε 3 κατηγορίες: ΑΝΑΦΑΣΗ Στη διαδικασία της κίνησης των χρωμοσωμάτων επάνω στους μικροσωληνισμους καθώς και στη γενικότερη οργάνωση της ατράκτου σημαντικό ρόλο παίζουν οι πρωτεΐνες κίνησης. Οι λειτουργίες τους μπορούν να διακριθούν σε 3 κατηγορίες: α. Σε αυτές που εντοπίζονται μεταξύ των πολικών μικροσωληνίσκων και πιθανώς παίζουν κάποιο ρόλο στο να διατηρούνται οι πόλοι μακριά. β. Στις πρωτεΐνες κίνησης που βρίσκονται στον κινετοχώρο και οι οποίες συμμετέχουν στις ταλαντώσεις που κάνουν τα χρωμοσώματα κατά την προμετάφαση, στη διατήρηση των χρωμοσωμάτων στη μεταφασική πλάκα και στο διαχωρισμό των χρωμοσωμάτων κατά την ανάφαση. γ. Στις πρωτεΐνες κίνησης που εντοπίζονται μεταξύ των αλληλοσυμπλεκόμενων μικροσωληνίσκων στην περιοχή του ισημερινού και είναι πιθανώς υπεύθυνες για την επιμήκυνση της ατράκτου κατά τη φάση της ανάφασης B.

Προτεινόμενο μοντέλο για τη δράση των πρωτεϊνών κίνησης κατά τη μίτωση. - +        α β γ (α) Προμετάφαση. Τα δύο μισά της μιτωτικής ατράκτου μετακινούνται σε αντίθετες κατευθύνσεις προς τους δύο πόλους που πιστεύεται ότι είναι αποτέλεσμα της δράσης των πρωτεϊνών κίνησης που κατευθύνονται στα + άκρα που προσδένονται στους πολικούς μικροσωληνίσκους (). Εν τω μεταξύ τα χρωμοσώματα έχουν προσδεθεί στους χρωμοσωμικούς μικροσωληνίσκους και ταλαντεύονται μπρος-πίσω πιθανώς σαν αποτέλεσμα της δράσης πρωτεϊνών κίνησης που κατευθύνονται είτε στα + () είτε στα – () άκρα και βρίσκονται στους κινετοχώρους. (β) Κατά τη μετάφαση τα δύο μισά της ατράκτου διατηρούν το διαχωρισμό τους σαν αποτέλεσμα της ενεργότητας των + κατευθυνόμενων πρωτεϊνών κίνησης των πολικών μικροσωληνίσκων (). Τα χρωμοσώμα παραμένουν στη μεταφασική πλάκα πιθανώς σαν αποτέλεσμα της ισορροπημένης ενεργότητας των πρωτεϊνών κίνησης που βρίσκονται στον κινετοχώρο (). (γ) Τέλος κατά την ανάφαση η κίνηση των χρωμοσωμάτων προς τους πόλους επιτυγχάνεται μέσω της δράσης των – κατευθυνόμενων πρωτεϊνών κίνησης (), ενώ ο διαχωρισμός των πόλων (ανάφαση Β) είναι αποτέλεσμα της συνεχόμενης ενεργότητας των + κατευθυνόμενων πρωτεϊνών κίνησης των πολικών μικροσωληνίσκων ().

Οι φάσεις της μίτωσης

ΤΕΛΟΦΑΣΗ Καθώς τα χρωμοσώματα φτάνουν στα δύο άκρα συσσωρέυονται σε μια μάζα. Το σημείο αυτό σηματοδοτεί και την έναρξη του τελικού σταδίου της μίτωσης που ονομάζεται τελόφαση μετά το πέρας της οποίας το κύτταρο επιστρέφει στην μεσοφασική κατάσταση. Ο πυρηνικός φάκελος επανασχηματίζεται καθώς μικρά μεμβρανικά κυστίδια περιβάλλουν τα χρωμοσώματα και συντήκονται μεταξύ τους έτσι ώστε τελικά να περιβάλλουν όλα τα χρωμοσώματα. Τα χρωμοσώματα στο στάδιο παύουν να είναι ορατά στο φωτονικό μικροσκόπιο, ενώ παράλληλα αρχίζει ο σχηματισμός του ER και του Golgi μέσω σύντηξης μεμβρανών.

ΚΕΝΤΡΑ ΟΡΓΑΝΩΣΗΣ ΜΙΚΡΟΣΩΛΗΝΙΣΚΩΝ (MTOC) Μελέτες με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο (TEM) έδειξαν ότι οι μικροσωληνίσκοι είναι οργανωμένοι γύρω από διάκριτες εστίες όπως κεντρίδια, βασικά σωμάτια και κινητοχώρους (στην περίπτωση των μεταφασικών χρωματοσωμάτων). Οι εστίες αυτές ονομάστηκαν από τον Ρickett Heaps «κέντρα οργάνωσης μικροσωληνίσκων» (ΜΤΟC micrοtubυle οrganizing centers). Τα πιο πολλά κύτταρα, περιέχουν κατά τη μεσόφαση, ένα ΜΤOC που σuνήθως βρίσκεται στην περιοχή του κεντροσώματος (κάπου στο κέντρο του κυττάρου) και αντιστοιχεί στο κεντρίδιο (ή κεντριόλιο, centriole), μαζί με τον περι-κεντριδικό χώρο. Κάθε ΜΤΟC, όπως και τα κεντρίδια, διπλασιάζεται κατά τη φάση S του κυτταρικού κύκλου όπως ήδη περιγράφηκε πιο πάνω. Έτσι τα ΜΤΟCs θα πρέπει να θεωρούνται σαν «κληρονομήσιμοι κυτταροπλασματικοί καθοριστές», που διαθέτουν προγραμματισμό οργάνωσης των μικροσωληνίσκων. Το μήκος των μικροσωληνiσκων αυτών μπορεί να ρυθμίζεται με τη συμμετοχή μικροϊνιδίων ακτίνης και ενδιάμεσων, ινιδίων χωρίς να είναι γνωστό πως ακριβώς πραγματοποιείται η ρύθμιση αυτή. Aκριβώς επειδή κληρονομούνται από πατρικό κύτταρο σε θuγατρικό, τα ΜΤΟC θεωρούνται σαν φορείς του κυτταρικού μεγέθους και σχήματος, προγραμματισμένα να σχηματίσουν μικροσωληνίσκους ορισμένου μήκους σε συγκεκριμένη χρονική στιγμή. Πειράματα του Βrinkley και συνεργατών έδειξαν πως πράγματι τα ΜΤΟC είναι υπεύθυνα για την ενεργότητα αυτή και όχι οι υπομονάδες τουμπουλίνης, γιατί απομονωμένα ΜΤΟC σχηματίζουν το καθορισμένο πλέγμα μικροσωληνίσκων ανεξάρτητα από την πηγή προέλευσης των μορίων τουμπουλίνης. Στην περίπτωση αυτή, το + άκρο των μικροσωληνίσκων είναι προς το αναπτυσσόμενο άκρο. Πάντως δεν αποκλείεται η συμμετοχή κυτταροπλασματικών παραγόντων (π.χ. φωσφορυλίωση «πρωτεϊνών που σχετίζονται με μικροσωληνίσκους» -ΜAΡ-micrοtubule assοciated prοteins) στη ρύθμιση του τελικού μήκους των ΜΣ (π.χ. με κάλυψη της τελευταίας υπομονάδας ώστε να μη μπορεί να προστεθεί νέο μόριο τουμπουλίνης).

Κεντροσωμάτια Τα κεντροσωμάτια (Κ) (centrοsοmes) είναι δομές που σχηματίζουν τους πόλους της ατράκτου σε όλα τα ζωικά κύτταρα, καθώς και σε πολλά κατώτερα φυτά και πρωτόζωα. Κατά τη μεσόφαση το Κ εντοπίζεται κοντά στον πυρήνα παίρνοντας θέση στο κέντρο περίπου του κυττάρου και κατευθύνει την οργάνωση των μικροσωληνίσκων. Στο σημείο αυτό παρατηρούνται δύο κεντρίδια (centriοles) σε αλληλοκάθετη θέση, καθώς και ηλεκτρονιόπυκνες δομές γύρω τους, που καλούνται «δορυφόροι». Συνήθως οι μικροσωληνίσκοι φαίνονται να τερματίζουν σε μια ζώνη γύρω από τα κεντρίδια (περικεντριδιακή περιοχή). Προσθήκη κολχικίνης έχει σαν αποτέλεσμα την εξαφάνιση των μικροσωληνίσκων, οι οποίοι μετά την απομάκρυνση της ουσίας αυτής φαίνονται να οργανώνονται ξανά από τα Κ επιβεβαιώνοντας έτσι τη δράση τους σαν ΜΤΟC. Το + άκρο των ΜΣ είναι μακριά από το Κ. Σε μερικά πρωτόζωα το κεντροσωμάτιο χρησιμεύει σαν οργάνωση ενός δικτύου ΜΣ που μετακινεί την τροφή από την περιφέρεια προς το κέντρο. Γενικά δεν είναι απαραίτητη η ύπαρξη κεντριδίου στο κεντρόσωμα και ενώ το τελευταίο είναι απαραίτητο για την οργάνωση των ΜΣ, στο Hλιόζωο Ηeterοphrys marina απουσιάζουν κεντρίδια, χωρίς όμως να uποβαθμίζεται ο ρόλος του κεντροσωματίου στην οργάνωση ΜΣ, γεγονός που σημαίνει ότι το κεντρίδιο δεν είναι απαραίτητο για την οργάνωση των ΜΣ. Κατά τη μίτωση, το κεντροσωμάτιο δρα σαν οργανωτής μικροσωληνίσκων (ΜTΟC), όπως προτάθηκε από τον Ροrter στο 1966, ενώ έμμεσα το Κ συντονίζει την οργάνωση και άλλων κυτταροσκελετικών ινιδίων. Aναπαράγεται και μεταβιβάζεται από κύτταρο σε κύτταρο μαζί με τα χρωμοσώματα, χωρίς όμως να περιέχει DNA ή RNA, όπως αποδεικνύεται αυτοραδιογραφικά. Σε εγκάρσιες τομές κάθε κεντρίδιο παρουσιάζει 9 τριπλέτες σωληνίσκων οι οποίες συνδέονται τός μεταξύ τους όσο και με το κέντρο μέσω ινιδίων. Κεντροσωμάτια υπάρχουν σε όσους ευκαρυωτικούς οργανισμούς διαθέτουν κύτταρο με μαστίγιο σε κάποιο στάδιο της ανάπτυξης τους, ενώ φαίνεται να απουσιάζουν π.χ. από αμοιβάδες, μονοκύτταρα ροδοφύκη, μερικά γυμνόσπερμα και από όλα τα ανθοφόρα φυτά. Υπάρχει δομική σχέση ανάμεσα στο Κ και στα «βασικά σωμάτια» που είναι οι ρίζες των μαστιγίων και βλεφαρίδων. Σχεδόν πάντα όμως είναι δυνατή η μετατροπή από τη μία λειτουργική οντότητα (κεντροσωμάτιο που λειτουργεί κατά την μιτωτική διαίρεση), στην άλλη (βασικό σωμάτιο).

(α) Κεντροσωμάτιο με δύο κεντρίδια (άσπρα βέλη) και δορυφόρους (μαύρα βέλη) και μικροσωληνίσκους). (β) Διαγραμματική απόδοση κεντροσώματος με δύο κεντρίδια, περικεντριδιακή περιοχή και πολυάριθμους μικροσωληνίσκους να ξεκινούν από αυτή. Στις δύο εικόνες εμφανίζεται το κεντρόσωμα σαν κέντρο οργάνωσης μικροσωληνίσκων (MTOC). (γ) Κεντρίδιο σε εγκάρσια τομή, Χ 200.000. (δ) Διαγραμματική τρισδιάστατη απεικόνιση του κεντριδίου όπου διακρίνονται οι 9 τριπλέτες (A, B, C) μικροσωληνίσκων που διατάσσονται υπό γωνία και κυκλικά με διάμετρο 1000 Å.

Η δημιουργiα των «κ» στην Chlamydοmοnas reinhardi περιλαμβάνει. α) σχηματισμό των 9 εσωτερικών σωληνίσκων β) προσκόλληση σε πεταλλοειδή μορφή της δεύτερης και μετά της τρίτης σειράς σωληνίσκων γ) αύξηση του κεντριδίου κατά μήκος. Όπου υπάρχουν γειτονικά κεντρίδια τότε έχει βρεθεί πως διατάσονται σε γωνία (πολλές φορές κάθετα) μεταξύ τους. Τα κεντρiδια εiναι απαραίτητα (εκτός του σχηματισμού της μιτωτικής ατράκτου) στο σχηματισμό βλεφαρiδων και μαστιγίων. Δομικά παρατηρείται μία μετάπτωση προχωρώντας από το κ στο μαστίγιο (ή τη βλεφαρίδα): οι Α (εσωτερικοi) σωληνίσκοι εξαφανίζονται με σταδιακή εμφάνιση ενός ζευγαριού στο κέντρο. Aυτή η δομή 9+2 είναι γενική στα μαστίγια και στις βλεφαρίδες με μικρές παραλλαγές (π.χ. 9+0 ή 9+7) σε σπερματοζωάρια εντόμων. H άμεση σχέση Κ με Β και Μ αποδεικνύεται με πειράματα αφαίρεσης του πρώτου οπότε παρατηρείται απώλεια των B και Μ που για να ξαναφτιαχτούν πρέπει πρώτα να γίνει κεντροσωμάτιο. Στη C. reinhardi τα κεντροσωμάτια (βασικά σωμάτια) πηγαίνουν προς το εσωτερικό του κυττάρου κατά την κυτταρική διαίρεση οπότε παρατηρείται αποδιάταξη του μαστιγίου. Στο τέλος της διαίρεσης νέα κεντροσωμάτια έρχονται προς την περιφέρεια, οπότε δημιουργούνται νέα μαστίγια.

Ο κύκλος του κεντροσώματος Στη φάση G1 το κύτταρο περιέχει ένα ζευγάρι κεντριολίων προσανατολισμένων σε σταθερή γωνία μεταξύ τους, ενώ από τον περικεντριολικό χώρο εκβάλλουν μικροσωληνίσκοι με το γρήγορα αυξανόμενο (μέσω πολυμερισμού τουμπουλίνης) θετικό τους άκρο να κατευθύνεται εκτός του κέντρου οργάνωσης. Κατά τη φάση S καθώς το DNA διπλασιάζεται δίπλα στα μητρικά κεντριόλια αρχίζουν να σχηματίζονται νέα κεντριόλια οπότε δημιουργούνται δύο ζεύγη εντός του κεντροσώματος. Τα κεντριόλια απόγονοι επιμηκύνονται σε όλη την G2 φάση και κατά την έναρξη της μίτωσης μεταναστεύουν μακριά το ένα από το άλλο στους δύο αντίθετους κυτταρικούς πόλους. Καθώς δε μεταναστεύουν οργανώνουν τα ινίδια μικροσωληνίσκων που θα διαμορφώσουν την μιτωτική άτρακτο. Ο κύκλος του κεντροσώματος Φάση G1 Φάση S ΜΙΤΩΣΗ

Ημισυντηρητικός διπλασιασμός κεντριδίων κατά τη φάση S του κυτταρικού κύκλου Με το μηχανισμό αυτό εξακολουθούν να συνυπάρχουν σε κάθε κύτταρο ένα παλαιό (π.χ. Α ή Β) και ένα νέο (π.χ. Α’ ή Β’) κεντρίδιο. Στην ηλεκτρονιογραφία διακρίνονται 4 κεντρίδια λίγο μετά τον διπλασιασμό των αρχικών.

Ανώμαλη μιτωτική διαίρεση στο ζωϊκό κύτταρο

ΚΥΤΤΟΚΙΝΗΣΗ Καθώς το κύτταρο εξασφαλίζει τον ακριβή διαχωρισμό των αδερφών χρωματίδων διαιρείται σε δύο κύτταρα απογόνους μέσω μιας διαδικασίας που ονομάζεται κυττοκίνηση. Το πρώτο σημείο για την επακόλουθη κυττοκίνηση εμφανίζεται στην όψιμη ανάφαση σαν μια αδρή εγκόλπωση της κυτταρικής επιφάνειας σε μια στενή ζώνη γύρω από το κύτταρο. Στη συνεχεια η εγκόλπωση βαθαίνει και μετατρέπεται σε ένα δαχτύλιο που περιβάλει το κύτταρο. Το επίπεδο του δακτυλίου είναι ίδιο με αυτό της μεταφασικής πλάκας. Ο δαχτύλιος στη συνέχεια συσφίγγεται συνεχώς μέχρι τα αντίθετα άκρα να ενωθούν και να προκληθεί αποκόληση των κυττάρων. Η σύσφιξη αυτή πιθανότατα προέρχεται από μια λεπτή ζώνη συσταλτού κυτταροπλάσματος κάτω ακριβώς από την πλασματική μεμβράνη που αποτελεί το φλοιό στην περιοχή του δαχτυλίου. Μικροσκοπική εξέταση του φλοιού έδειξε την ύπαρξη μεγάλου αριθμού ινιδίων ακτίνης που φαίνεται να προσανατολίζονται παράλληλα προς το δαχτύλιο διαχωρισμού. Ανάμεσα δε στα ινίδια ακτίνης βρίσκονται μια σειρά από κοντά διπολικά ινίδια μυοσίνης ΙΙ. Φαίνεται δε ότι η δύναμη που καθοδηγεί τη διαίρεση είναι παρόμοια με αυτή που παρατηρείται κατά την συστολή των μυϊκών κυτταρων που βασίζεται σε ενεργότητα ακτινής-μυοσίνης. Το γλίστρημα των ινιδίων του συσταλτού δαχτυλίου σπρώχνει τον φλοιό και την προσδεδεμένη πλασματική μεμβράνη προς το κέντρο του κυττάρου. Ο φλειώδης δαχτύλιος διαμορφώνεται και αποδιαμορφώνεται πολύ γρήγορα πριν και μετά το πέρας της κυττοκίνησης αντίστοτχα. Τα ινίδια ακτίνης και μυοσίνης είναι όμοια με αυτά του κυτταροσκελετού κατά τη μεσόφαση. Ενώ δε η μίτωση και η κυττοκίνηση είναι στενά συνδεδεμέμνες διαδικασίες φαίνεται ότι για η κυττοκίνηση μπορεί να λάβει χώρα ακόμη και αν αφαιρεθεί όλη η μιτωτική άτρακτος με τα χρωμοσώματα. Τέλος σημειώνεται ότι στα φυτικά κύτταρα η κυττοκίνηση λαμβανει χώρα όχι μέσω σύσφιξης αλλά μέσω πλευρικής απόθεσης πλασματικής μεμβράνης και κυτταρικού τοιχώματος στο επίπεδο της μεσοφασικής πλάκας και περιλαμβάνει μικροσωληνίσκους και ενεργή μεταφορά υλικού μέσω κυστιδίων Golgi. Κυττοκίνηση όπως περιγράφηκε πιό πάνω παρατηρείται στα ζωικά κύτταρα, στα Πρώτιστα και σε ορισμένα φυτικά κύτταρα.

Ο σχηματισμός και η λειτουργία του συσταλτού δακτυλίου κατά τη κυττοκίνηση κύτταρα απόγονοι εγκόλπωση αποχωρισμού συσταλτός δακτύλιος ινίδιο ακτίνης ινίδιο μυοσίνης Τα ινίδια ακτίνης αυτοσυγκροτούνται σε ένα δακτύλιο στον ισημερινό του κυττάρου, όπου λόγω συστολών (για τη δημιουργία των οποίων απαιτείται η δράση της μυοσίνης) προκαλείται ο σχηματισμός της εγκόλπωσης (σύσφιξης) που διαιρεί το κύτταρο στα δύο.

Ο σχηματισμός και η λειτουργία του συσταλτού δακτυλίου κατά τη κυττοκίνηση

ΚΥΤΤΟΚΙΝΗΣΗ – ΦΥΤΙΚΟ ΚΥΤΤΑΡΟ Στα κύτταρα των ανώτερων φυτών δημιουργείται «κυτταρική πλάκα» που αρχίζει από το μέσο της ατράκτου και σιγά σιγά επεκτείνεται σε όλο το πλάτος του διαιρούμενου κυττάρου. H νέα πλασματική μεμβράνη σχηματίζεται από κατάλοιπα του ενδοπλασματικού δικτύου (φραγμοπλάστης).

ΜΟΡΙΑΚΟΙ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ ΠΟΥ ΕΛΕΓΧΟΥΝ ΤΗ ΜΙΤΩΣΗ Οπως ήδη αναφέρθηκε ο παράγων προώθησης της μίτωσης (ΜPF, mitosis promoting factor) είναι ένα ετεροδιμερές που αποτελείται από μια κυκλίνη της μίτωσης και μια κυκλινο-εξαρτώμενη κινάση. Το ενεργοποιημένο σύμπλοκο διεγείρει την έναρξη της μίτωσης φωσφορυλιώνοντας πολλά υποστρώματα, ενώ προκειμένου να ολοκληρωθεί η μίτωση απαιτείται η πρωτεόλυση των μιτωτικών κυκλινών γεγονός που οδηγεί στη μείωση της ενεργότητας του παράγοντα MPF. Η επιλεκτική πρωτεόλυση των μιτωτικών κυκλινών επιτυγχάνεται μέσω ενός τμήματος 9 αμινοξικών καταλοίπων που ονομάζεται “κουτί καταστροφής” (destruction box) το οποίο αναγνωρίζεται από ένζυμα του συστήματος της ουμπικιτίνης και ειδικότερα από το σύμπλοκο πολλαπλών υπομονάδων προώθησης της ανάφασης (APC, anaphase promoting complex). Μέσω του συμπλόκου αυτού κατάλοιπα ουμπικιτίνης μεταφέρονται στις μιτωτικές κυκλίνες οι οποίες έτσι μαρκάρονται στην όψιμη ανάφαση και στη συνέχεια οδηγούνται στο πρωτεόσωμα προκειμένου να πρωτεολυθούν σε σύντομο χρονικό διάστημα. Το σύμπλοκο APC πιθανότατα φωσφρουλιώνεται και ενεργοποιείται από τον MPF ενώ η απενεργοποίηση του συμπλόκου προς το τέλος της φάσης G1 επιτρέπει τη σταδιακή συσσώρευση των μιτωτικών κυκλινών. Αν και οι πρωτεϊνες στόχοι του MPF δεν έχουν βρεθεί πιστεύεται ότι ρυθμίζουν όλα τα σημαντικά γεγονότα της μίτωσης όπως η συμπήκνωση των χρωμοσωμάτων, η διάλυση του πυρηνικού φακέλου, ο σχηματισμός της πυρηνικής ατράκτου, η κίνηση των χρωμοσωμάτων στους αντίθετους πόλους, ο επανασχηματισμός των οργανιδίων και η κυττοκίνηση. Κάποιες από τις διαδικασίες αυτές ελέγχονται με αποφωσφορυλίωση και κάποιες με πρωτεϊνική αποδόμηση. Η μείωση των μιτωτικών κυκλινών και του MPF συμβαδίζει με τα όψιμα στάδια της μίτωσης (όψιμη ανάφαση και τελόφαση). Η φωσφορυλίωση των πρωτεινών που συνδέονται με μικροσωληνίσκους από τον MPF πιθανώς απαιτείται για τις δραματικές αλλαγές στη δυναμική των μικροσωληνίσκων που έχει σαν αποτέλεσμα το σχηματισμό της μιτωτικής ατράκτου και των αστεροειδών μικροσωληνίσκων.

πυρηνική μεμβράνη χρωματίνη λάμινα πυρηνικός πόρος C τετραμερές λαμίνης MFP φωσφορυλιωμένα διμερή λαμίνης Σχηματική αναπαράσταση των μοριακών γεγονότων που οδηγούν στη διάλυση του πυρηνικού φακέλου κατά τη μίτωση και σχετίζονται με τη φωσφορυλίωση των λαμινών του πυρηνικού φακέλου από τον MFP παράγοντα. Η φωσφορυλίωση αυτή αποδιατάσει το κανονικό πλέγμα που κανονικά υπάρχει στον πυρηνικό φάκελο και είναι αποτέλεσμα των αλληλεπιδράσεων των μη-φωσφορυλιωμένων λαμινών.

Η φωσφορυλίωση των λαμινών του πυρηνικού φακέλου από τον MPF οδηγεί στην κατάρρευση της πυρηνικής μεμβράνης. Ο πυρηνικός φάκελος αποτελείται από διπλή μεμβράνη και περιέχει πολλούς πυρηνικούς πόρους. Η λιπιδική στοιβάδα της εσωτερικής μεμβράνης αποτελείται από την πυρηνική λάμινα που αποτελεί ένα δίκτυο ινιδίων λαμίνης (Α, B, C, ενδιάμεσα ινίδια που συμμετέχουν στην υποστήριξη μεμβρανών) που τοποθετούνται κοντά στην εσωτερική επιφάνεια του φακέλου. Οι λαμίνες A, C κωδικοποιούνται από το ίδιο μετάγραφο με εναλακτικό μάτισμα και είναι όμοιες εκτός από μια περιοχή 133 αμινοξέων στο καρβόξυ άκρο της λαμίνης Α που δεν υπάρχει στη C. Αντίθετα η λαμίνη Β κωδικοποιείται από άλλο μετάγραφο και τροποποιείται μετα-μεταφραστικά μέσω πρόσθεσης μιας υδρόφοβης ομάδος ισοπρενίου (isoprenyl) κοντά στο καρβόξυ- άκρο. Με το κατάλοιπο αυτό προσδένεται στη λιπιδική διπλοστοιβάδα προσδένοντας έτσι την πυρηνική λαμίνη στη μεμβράνη. Και οι τρείς λαμίνες σχηματίζουν διμερή που περιέχουν μια α-ελικοειδή κεντρική περιοχή και σφαιρικά τμήματα στα δύο άκρα μέσω των οποίων λαμβάνουν χώρα και οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ των μορίων που δημιουργούν τα ενδιάμεσα ινίδια που αποτελούν την πυρηνική λάμινα. Κατά την αρχή της μίτωσης ο MPF φωσφορυλιωνει συγκεκριμένα κατάλοιπα σερίνης και στις τρεις πυρηνικές λαμίνες προκαλώντας έτσι αποπολυμερισμό του πλέγματος. Οι A, C, λαμίνες απελευθερώνονται από τη μεμβράνη ενώ αντίθετα η λαμίνη B παραμένει αγκυροβολημένη στη πυρηνική μεμβράνη. Ο αποπολυμερισμός αυτός συνεισφέρει στον τεμαχισμό της πυρηνικής μεμβράνης σε μικρά κυστίδια.

Η επανασυγκρότηση του πυρηνικού φακέλου και η κυτοκίνηση απαιτούν ενεργότητα φωσφατάσης Οταν ο MPF απενεργοποιείται λόγω αποδόμησης της κυκλίνης Β κατά την όψιμη ανάφαση η δράση των φωσφατασών είναι ανεμπόδιστη και έχει σαν αποτέλεσμα την αποφωσφορυλίωση των λαμινών. Τα κυστίδια που προέκυψαν από την κατάρρευση του πυρηνικού φακέλου κατά την πρόφαση συνδέονται με την επιφάνεια των αποσυμπηκνούμενων χρωμοσωμάτων κατά την τελόφαση. Τα κυστίδια αυτά συντήκονται προκειμένου να φτιάξουν συνεχείς διπλές μεμβράνες γύρω από κάθε χρωμόσωμα ενώ παράλληλα επανασχηματίζονται και οι πυρηνικοί πόροι (οι μικροπυρήνες γύρω από κάθε χρωμόσωμα ονομάζονται καρυομερή). Στη συνεχεια η σύντηξη των καρυομερών που συνδέονται με κάθε πόλο δημιουργεί τους δύο θυγατρικούς πυρήνες καθένας από τα οποία περιέχει ένα πλήρες σετ από χρωμοσώματα. Οι λαμίνες A, C εισέρχονται από τους πυρηνικούς πόρους και επανασυνδέονται στην νέα πυρηνική λάμινα. Η επανασυγκρότηση της πυρηνικής λάμινας πιθανότατα γίνεται μέσω των ινιδίων της λαμίνης Β τα οποία παραμένουν συνδεδεμένα (αγκυροβολημένα) με τα κυστίδια του πυρηνικού φακέλου κατά τη μίτωση. Οι φάσεις της μίτωσης ρυθμίζονται και από τη συγκέντρωση του ενδοκυτταρικού ασβεστίου. http://www.johnkyrk.com/mitosis.html