ΕΜΒΙΟΜΗΧΑΝΙΚΗ-ΒΙΟΪΑΤΡΙΚΗ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΑΚΑΔΗΜΑΪΚΟ ΕΤΟΣ ΒΙΟΛΟΓΙΚΗ-ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΠΑΡΟΥΣΙΑΣΗ Protein Determination by the BCA method Protein Determination by the BCA method Team B03: Δαβιλάς Κωνσταντίνος Team B03: Δαβιλάς Κωνσταντίνος Ζαχαροπούλου Έλλη-Άννα Ζαχαροπούλου Έλλη-Άννα

Πρωτεΐνες  Βιολογικά μακρομόρια που αφθονούν και ποικίλουν λειτουργικά σε ζωντανούς οργανισμούς  Κατηγοριοποίηση βάση λειτουργίας, δομής και σύνθεσης  Αποτελούνται από αμινοξέα που συνδέονται μεταξύ τους με πεπτιδικούς δεσμούς σχηματίζοντας την πολυπεπτιδική αλυσίδα

 Αμινοξύ: καρβοξυλομάδα, αμινομάδα, R-oμάδα

Μελέτη Πρωτεϊνών Στόχος: Απομόνωση πρωτεϊνών, εύρεση λειτουργικότητα δομής και μορφής, Διάσπαση αμινοξέων και ανάλυσή τους Βήματα: Protein Purification 1) Eντοπισμός πρωτεΐνης και εύρεση συγκέντρωσης 2) Φυγοκέντρηση 3) Διαχωρισμός πρωτεϊνών (εξαλάτωση, διαπήδηση, Χρωματογραφία διήθησης σε πήκτη, Χρωματογραφία ιοντοανταλλαγών)

Ανάλυση αμινοξέων: Απελευθέρωση αμινοξέων, Χρήση φθορίζουσων ουσιών(dabsyl), Edman, RP-HPLC, RP χρωματογραφία  Σημαντικό μέρος της ανάλυση πρωτεϊνών  Εργαστήρια-Πολλαπλές μεθόδους  Η συγκέντρωση των πρωτεϊνών εκφράζεται με τους εξής τρόπους: Molarity: mol/L Amount/vol: mg/mL (mg/dL) % solution: 1% sol’n=1g/100mL Enzyme activity: μmol Product(minmL E) ή SI 1 katal Καθορισμός Συγκέντρωσης

 Παράγοντες που επηρεάζουν επιλογή μεθόδου a. Παρουσία μη πρωτεϊνικών παραγόντων στο ρυθμιστικό διάλυμα b. H ταχύτητα και απλότητα διεκπεραίωσης της δοκιμασίας και της ανάλυσης των αποτελεσμάτων c. Το κόστος διεξαγωγής του πειράματος και αγοράς της μεθόδου d. Η ακρίβεια και η απαιτούμενη ευαισθησία (ικανότητα μέτρησης συγκέντρωσης) e. Η φύση της πρωτεϊνης που επιθυμούμε να μετρηθεί f. Τα μέσα που διαθέτει το εργαστήριο (π.χ ύπαρξη φασματοφωτόμετρου ή plate reader )  Μέτρησα την συγκέντρωση! Τι κάνω μετά ; SDS-PAGE(ηλεκτροφόρτιση:διαχωρισμός πρωτεϊνών ανάλογα με το μέγεθός τους), mass spectometry(χαρακτηρισμός πρωτεϊνών), Edman’s degradation (μέθοδος διαχωρισμού αμινοξέων μιας πολυπεπτιδικής αλυσίδας), Nuclear magnetic resonance(πληροφορίες για την δυναμική και δομή των πρωτεϊνών), ligand binding studies (σύνδεση ενός συνδέτη ligand με πρωτεϊνη στόχο).

Μέθοδοι προσδιορισμού συγκέντρωσης Γενικά χρωματομετρικές μεθόδους αλλά και φασματοσκοπικές  Φασματογραφία: Ικανότητα πρωτεϊνών(ή και προσθετικών ομάδων) να απορροφούν φως σε μια UV περιοχή ορατού φάσματος Χαμηλή συγκέντρωση πρωτεϊνών Χαμηλή απορροφητικότητα Χρήση νόμου Beer-Lambert (Α=kc)  Χρωματομετρικές: Αλλαγή χρώματος +μέτρηση σε plate reader

Biuret Method  Πατέρας όλων των μεθόδων και βάση για τις υπόλοιπες  Εμφάνιση μωβ χρώματος, Προσδιορισμός συγκέντρωσης με καμπύλή γνωστής βαθμονόμησης + Γρήγορη αλλαγή χρώματος, το χρώμα παραμένει - Ακριβή, χαμηλή ευαισθησία(κατώτερο όριο 2mg/ml), παρεμπόδιση αντίδρασης από Tris(ρυθμ. Διαλυμα) και θεικό αμμώνιο

Modified Lowry Protein Assay  1951 Oliver H. Lowry, Ενισχυμένη δοκιμασία Biuret  Αμινοξέα που ενισχύουν χρώμα (tyr,trp,cys,his,asp) + Mέτρηση από nm wavelength, ευαίσθητη, εύρος λειτουργίας mg/ml, επώαση σε θερμοκρασία δωματίου - Μεγάλος χρόνος διεκπεραίωσης, το χρώμα ξεθωριάζει γρήγορα, ευαίσθητο σε ουσίες που αντιτίθενται στην δημιουργία χρώματος ή παράγουν από μόνας τους

Bradford Assays  Dr. Marion Bradford 1976 (Coomassie assay kit, Coomassie plus-The Better Bradford) + γρήγορη, φθηνή, υψηλή ευαισθησία - Ασυμβατότητα με επιφανειοδραστικές ουσίες, χρωματισμός κυψελίδας,όξινο περιβάλλον άρα δυσκολία προσδιορισμού κάποιων πρωτεϊνών

Resazurin protocol Η ρεσαζουρίνη διαλύεται σε ρυθμιστικό διάλυμα(μπλε). Βιώσιμα κύτταρα+ρεσαζουρίνη=ρεσορουφίνη(ροζ φθορίζον χρώμα) +φθηνή, ευαίσθητη, δεν απαιτείται λύση κυττάρων -μεγάλος χρόνος επώασης, επηρεάζεται από ουσίες που παρεμβάλλουν απορρόφηση ΜΤΤ protocol Το κίτρινο διάλυμα MTT ανάγεται σε μωβ φορμαζόνη, έυρος συγκεντρώσεων 0,2-0,5mg/ml +χρήσιμη μέθοδος κυρίως για μέτρηση κυττάρων - Επώαση 1-4 ώρες

Μέθοδος φθορισμού: χρήση αρωματικών αμινοξέων Μέθοδος Α280 ε 280 nm (M -1 cm -1 ) = (#Trp)(5500)+ (#Tyr)(1490)+(#Cys)(125) + Ευκολία διεξαγωγής, δεν καταστρέφει δείγματα, υψηλή ευαισθησία -Γνώση αμινοξέων σε δείγματα, καθαρά δείγματα UV Απορρόφηση

Ειδικές Μέθοδοι  Easy-Titer® IgG and IgM Assay Kits Ποσοτικός προσδιορισμός αντισωμάτων, γλυτώνω χρήση χρωματομετρικών διαδικασιών, διαρκεί 30 min  Glycoprotein Carbohydrate Estimation Kit Προσέγγιση περιεκτικότητας μιας πρωτεϊνης σε υδατάνθρακες  Histidine-Tagged Protein Detection Ανίχνευση ιστιδίνης ή πρωτεϊνών πλούσιες σε ιστιδίνη

Πειραματική Διαδικασία  BSA(Bovine Serum Αlbumin)  BUFFER ¼ LYSIS ¾ PBS Σαπούνι PI (Phosphatase Inhibitor) PMSF (PhenylMethaneSulfonylFluoride)

Πειραματική Διαδικασία 2/3 mg/ml BUF 2/9 mg/ml BUF 2/27 mg/ml BUF 2/81 mg/ml BUF 2/243 mg/ml BUF 12 μ l BSA (PBS) 9 μ l lysis 15 μ l PBS 3-fold

Πειραματική Διαδικασία 2/3 mg/ml BUF 2/9 mg/ml BUF 2/27 mg/ml BUF 2/81 mg/ml BUF 2/243 mg/ml BUF 12 μ l BSA (PBS) 9 μ l lysis 15 μ l PBS BUF 20 BUF 20 BUF 18 BUF fold

Βήματα 3-fold αραίωσης

 Βήμα 1: Δημιουργία των κατάλληλων αραιώσεων  Βήμα 2: Παρασκευή Working Reagent και ανάμιξή του  Βήμα 3: Επώαση της πλάκας των δειγμάτων στο incubator στους 37 ο C για 30 λεπτά  Βήμα 4: Μέτρηση της απορροφητικότητας κάθε well με χρήση φασματοφωτόμετρου-plate reader  Βήμα 5: Κατασκευή της καμπύλης σημείων με τεταγμένη την απορροφητικότητα και τετμημένη την συγκέντρωση  Βήμα 6: Εύρεση της βέλτιστης δυνατής ευθείας με μορφή y=ax+b που περνάει όσο το δυνατόν κοντύτερα από τα σημεία (μέθοδος ελαχίστων τετραγώνων)  Βήμα 7: Δεδομένου της καμπύλης και της μετρημένης απορροφητικότητας των δειγμάτων βρίσκουμε την συγκέντρωσή τους και στην συνέχεια της μάζα τους και τον αριθμό των κυττάρων

Πειραματική Διαδικασία 3-fold

Πειραματική Διαδικασία 3-fold

Πειραματική Διαδικασία P(mg/ml)*4*V(ml) = m(mg) m(ng) m(ng)/0.5(ng/cell)=cells 3-fold

Πειραματική Διαδικασία 3-fold

Πειραματική Διαδικασία 2-fold

Πειραματική Διαδικασία P(mg/ml)*4*V(ml) = m(mg) m(ng) m(ng)/0.5(ng/cell)=cells 2-fold

Πειραματική Διαδικασία 2-fold