Εργαστήριο Επιστήμης Υλικών ΙΙ Ανοικτά Ακαδημαϊκά Μαθήματα στο ΤΕΙ Αθήνας Εργαστήριο Επιστήμης Υλικών ΙΙ Ενότητα 8: Απομόνωση της καζεΐνης από το γάλα και ιδιότητές της Σταμάτης Μπογιατζής, επίκουρος καθηγητής Τμήμα Συντήρησης Αρχαιοτήτων & Έργων Τέχνης Το περιεχόμενο του μαθήματος διατίθεται με άδεια Creative Commons εκτός και αν αναφέρεται διαφορετικά Το έργο υλοποιείται στο πλαίσιο του Επιχειρησιακού Προγράμματος «Εκπαίδευση και Δια Βίου Μάθηση» και συγχρηματοδοτείται από την Ευρωπαϊκή Ένωση (Ευρωπαϊκό Κοινωνικό Ταμείο) και από εθνικούς πόρους.

Βασικοί όροι Πρωτεΐνες, Αμινοξέα, Καζεΐνη, Καζεϊνικό ασβέστιο, Ισοηλεκτρικό σημείο, Φωσφοπρωτεΐνη, Κροκίδωση, Τεστ διουρίας.

Στόχος του εργαστηριακού μαθήματος Κατανόηση της χημικής σύστασης των πρωτεϊνών, Εξοικείωση με την προέλευση και τις χρήσεις της καζεϊνης, Η εξοικείωση με τις ηλεκτρικές ιδιότητες των πρωτεϊνών , Η επίδραση οξέων και βάσεων στη δομή τους, Η εξοικείωση με χημικές τεχνικές απομόνωσης και καθαρισμού υλικών.

Γενικά (1 από 2) Στις πρωτεΐνες τα ενωμένα αμινοξέα συγκροτούνται σε αλυσίδες μεγάλου μοριακού βάρους στις οποίες οι «κρίκοι» (δηλ. τα αμινοξέα) συνδέονται μεταξύ τους με πεπτιδικούς δεσμούς, αμινοξύ1 αμινοξύ2 αμινοξύ3 Η2Ν COO- Οι μαύρες κουκίδες: πεπτιδικές ομάδες (-CO-NH-) παρεμβάλλονται ανάμεσα σε δύο διαδοχικά αμινοξέα Στα δυο άκρα των αλυσίδων υπάρχουν αντίστοιχα δυο τελικά αμινοξέα εκ των οποίων το ένα διαθέτει ελεύθερη αμινομάδα (Ν-τελικό αμινοξύ) και το άλλο διαθέτει ελεύθερη καρβοξυλική ομάδα (C-τελικό αμινοξύ).

Γενικά (2 από 2) Κάθε πρωτεΐνη συμπεριφέρεται σαν αμφοτερικό μόριο, όπως ακριβώς και τα ίδια τα αμινοξέα που την απαρτίζουν, Δηλαδή διαθέτουν μια ομάδα που συμπεριφέρεται σαν βάση (αμινομάδα) και μια που συμπεριφέρεται σαν οξύ (καρβοξυλική ομάδα), Συνεπώς, και εδώ όπως και στα αμινοξέα, υπάρχει η έννοια του ισοηλεκτρικού σημείου, στο οποίο και οι δυο ομάδες είναι φορτισμένες.

Επίδραση του pH (1 από 2) Οι πρωτεΐνες είναι σύνθετα μόρια, και το pH παίζει σε αυτές ένα σημαντικό ρόλο. πρωτεΐνη Όξινη μορφή Αλκαλική μορφή Ουδέτερη μορφή: Το pH του διαλύματος ονομάζεται ισοηλεκτρικό σημείο (p I) Σε όξινο διάλυμα (pH<pI), είναι φορτισμένες μόνο οι αμινομάδες (ΝΗ3+), ενώ σε αλκαλικό (pH> pI), είναι φορτισμένες μόνο οι καρβοξυλικές ομάδες (COO-).

Επίδραση του pH (2 από 2) Στην όξινη και αλκαλική μορφή όλο το μόριο φέρει ένα μόνο είδος φορτίου (θετικό, ή αρνητικό αντίστοιχα) Αποτέλεσμα: ασκείται μια σημαντική ηλεκτροστατική άπωση μεταξύ των μορίων. πρωτεΐνη Όξινη μορφή (μόνο θετικά φορτία) Αλκαλική μορφή (μόνο αρνητικά φορτία) Άπωση μεταξύ μορίων Άπωση μεταξύ μορίων Ουδέτερη μορφή (θετικά και αρνητικά φορτία)

Ακραίες τιμές pH Όταν η πρωτεΐνη βρίσκεται σε όξινο διάλυμα (pH<pI), οι αμινομάδες είναι φορτισμένες (-ΝΗ3+), Όταν βρίσκεται σε αλκαλικό (pH>pI), είναι φορτισμένες μόνο οι καρβοξυλικές ομάδες (COO-), Στην όξινη και αλκαλική μορφή όλο το μόριο φέρει ένα μόνο είδος φορτίου (θετικό, ή αρνητικό αντίστοιχα) με αποτέλεσμα να ασκείται μια σημαντική ηλεκτροστατική άπωση μεταξύ των μορίων.

Ενδιάμεσο pH: Ισοηλεκτρικό σημείο πρωτεϊνών Στο ισοηλεκτρικό σημείο (pI) συνυπάρχουν θετικά και αρνητικά φορτία σε κάθε μόριο (διπλά φορτισμένη ιοντική μορφή) με αποτέλεσμα αυτό να προσανατολίζεται σε σχέση με τα γειτονικά προς αυτό μόρια που έχουν αντίστοιχα φορτία, ή Αποτέλεσμα: εμφανίζεται ηλεκτροστατική έλξη μεταξύ των μακρομορίων των πρωτεϊνών με αποτέλεσμα αυτές να συσσωματώνονται και τελικά να καθιζάνουν από τα υδατικά τους διαλύματα. Το φαινόμενο λέγεται κροκίδωση.

Καζεΐνη: η πρωτεΐνη του γάλακτος (1 από 2) Καζεΐνη: η πρωτεΐνη του γάλακτος (1 από 2) Η κύρια πρωτεΐνη του γάλακτος , η καζεΐνη, είναι μια φωσφοπρωτεΐνη (δηλαδή υπάρχουν συνδεδεμένες φωσφορικές ομάδες). πρωτεΐνη φωσφορική ομάδα

Καζεΐνη: η πρωτεΐνη του γάλακτος (2 από 2) Καζεΐνη: η πρωτεΐνη του γάλακτος (2 από 2) πρωτεΐνη Η παρουσία των φωσφορικών ομάδων κάνει το ισοηλεκτρικό σημείο των καζεϊνών να είναι πιο όξινο από το συνηθισμένο (pΙ =4.6), Επειδή το παρατηρούμενο pH του γάλακτος είναι ψηλότερο (6.7 - 6.8) από το pΙ, οι φωσφορικές ομάδες βρίσκονται σε μορφή ανιόντων (δηλ. αρνητικά φορτισμένες).

Η μορφή της καζεΐνης στο γάλα Οι φωσφορικές ομάδες της καζεΐνης έχουν κάποιους σημαντικούς ρόλους: (α) επειδή στο pH (6.7 - 6.8) του γάλακτος απαντώνται σε μορφή ανιόντος, μπορούν και σχηματίζουν άλας (καζεϊνικό ασβέστιο) με τα ιόντα του ασβεστίου που υπάρχουν στο περιβάλλον τους, (β) η παρουσία των φορτίων στα φωσφορικά ανιόντα σε μια από τις πολλές μορφές καζεΐνης στο γάλα (την κ- καζεΐνη) προκαλεί τη δημιουργία μικκυλίων, Στο pH του γάλακτος, τα μικκύλια της καζεΐνης είναι αρνητικά φορτισμένα και συνεπώς απωθούνται, Γιαυτό το λόγο γάλα δεν περιέχει ίζημα (δηλαδή είναι ένα σταθερό γαλάκτωμα).

Κροκίδωση του γάλακτος Όταν προστεθεί στο γάλα μια ποσότητα οξέος (υδροχλωρικού, οξικού, κλπ.) αρχίζουν και πρωτονιώνονται οι φωσφορικές ομάδες, δηλαδή καταστρέφεται το άλας του καζεϊνικού ασβεστίου, Αποτέλεσμα: να εμφανίζεται έλξη μεταξύ των συσσωματωμάτων (μικκυλίων) της πρωτεϊνης, Αυτός είναι ο λόγος που κροκιδώνεται (ή κοινώς «κόβει») το γάλα όταν προσθέσουμε οξύ.

Σκοπός του πειράματος Το πείραμα έχει ως σκοπό τη χρήση των οξεοβασικών ιδιοτήτων των πρωτεϊνών, ώστε μέσω της κροκίδωσής τους σε όξινο περιβάλλον να αποχωρίζονται από το διάλυμα που τις φιλοξενεί, Με αυτό τον τρόπο θα απομονωθεί η καζεΐνη από το γάλα, Στη συνέχεια θα ακολουθήσει ο καθαρισμός της από προσμίξεις (τους υδατάνθρακες και το λιπαρό κλάσμα του γάλακτος). Διάρκεια: 2 ώρες.

Απαιτούμενα όργανα και αντιδραστήρια Απαιτούμενα υλικά: Δείγμα: γάλα (κατά προτίμηση φρέσκο, χαμηλά λιπαρά, ή πλήρως αποβουτυρωμένο), Χημικά: πυκνό (παγόμορφο) οξικό οξύ, αιθανόλη 95%, αιθέρας, ΝαΟΗ 10%, Σκεύη: υδροβολέας, κωνική φιάλη 150-250ml, ποτήρι ζέσεως 500 ml (υδατόλουτρο) και 100 ml, θερμόμετρο 0-100°C, ύφασμα με πόρους (τούλι), μεταλλική σπάτουλα, σύστημα διήθησης υπό κενό (χωνί Buchner, κατάλληλη κωνική φιάλη με κωνικό προσαρμοστήρα από καουτσούκ και κυκλικά κομμένο ηθμό).

Διαδικασία παρασκευής της καζεΐνης (1 από 3) Ζυγίζεται ποσότητα m=50.0 g γάλακτος (με χαμηλά λιπαρά, ή πλήρως αποβουτυρωμένο) σε μια κωνική φιάλη των 250 ml και ακολούθως θερμαίνονται σε υδατόλουτρο εφοδιασμένο με θερμόμετρο υπό ανάδευση. Όταν η θερμοκρασία φθάσει τους 40°C απομακρύνουμε τη φιάλη από το υδατόλουτρο και προσθέτουμε σταδιακά 10 σταγόνες πυκνού οξικού οξέος υπό συνεχή ανάδευση (η προσθήκη γίνεται στον απαγωγό). Καταγράφονται οι παρατηρούμενες μεταβολές. Όταν ολοκληρωθεί ο σχηματισμός ιζήματος, το ετερογενές μίγμα διηθείται μέσω πορώδους υφάσματος (π.χ. τούλι) που έχει στερεωθεί στην κορυφή ενός ποτηριού ζέσεως των 100 ml. Με τη βοήθεια υδροβολέα εκπλύνονται τα τοιχώματα της φιάλης μέχρι να μεταφερθεί στο ύφασμα όλη η ποσότητα του στερεού προϊόντος.

Διαδικασία παρασκευής της καζεΐνης (2 από 3) Αφού έχουμε βεβαιωθεί ότι όλη η ποσότητα του νερού έχει περάσει μέσα στο ποτήρι, το ίζημα επάνω στο ύφασμα μεταφέρεται στην κωνική με τη βοήθεια σπάτουλας και σχολαστικών εκπλύσεων, Προσθέτουμε 20 ml αιθανόλης 95% στη φιάλη με το στερεό. Αφού αναδευτεί το μίγμα επί 5 min με τη βοήθεια γυάλινης ράβδου, αφήνουμε το στερεό να κατακαθίσει στον πυθμένα της φιάλης και στη συνέχεια αποχύνεται προσεκτικά η φάση της αιθανόλης με το λιπαρό συστατικό, Ετοιμάζουμε παράλληλα, το σύστημα διήθησης υπό κενό (όπου ο κυκλικά κομμένος ηθμός έχει προζυγιστεί).

Διαδικασία παρασκευής της καζεΐνης (3 από 3) Μεταφέρουμε τη φιάλη με το προϊόν στον απαγωγό και προσθέτουμε 25 ml μίγματος αιθανόλης-αιθέρα 50:50. Μετά από ανάδευση 5 min, το μίγμα διηθείται υπό κενό. Ο ηθμός με το ίζημα μεταφέρονται επάνω σε ένα τετράγωνο κομμάτι διηθητικού χαρτιού μέχρι να ξηρανθεί, Ζυγίζουμε το σύνολο ιζήματος-χαρτιού και υπολογίζουμε την % απόδοση της διαδικασίας (ή την % ανάκτηση του προϊόντος).

Έλεγχος καζεΐνης ως πρωτεϊνικού υλικού (1 από 3) (α) αντίδραση νινυδρίνης : μια μικρή ποσότητα (10mg) από το στερεό που παραλήφθηκε κατά την προηγούμενη διαδικασία διαλύεται σε 1 ml απιονισμένου νερού και προσθέτουμε μια σταγόνα νινυδρίνης, Τοποθετείται ο σωλήνας στο υδατόλουτρο επί 4-5 λεπτά μέχρι να παρατηρηθεί προϊόν μπλε-μωβ χρώματος.

Έλεγχος καζεΐνης ως πρωτεϊνικού υλικού (2 από 3) (β) Ξανθοπρωτεϊνική αντίδραση : ποσότητα (10mg) από το στερεό που παραλήφθηκε κατά την προηγούμενη διαδικασία διαλύεται σε 1 ml απιονισμένου νερού και προσθέτουμε πυκνό νιτρικό οξύ (μέσα στους απαγωγούς, με πολλή προσοχή!), Τοποθετούμε το σωλήνα στο υδατόλουτρο για 5 λεπτά, και σημειώνουμε την αλλαγή του χρώματος. Εμφάνιση κίτρινου χρώματος υποδηλώνει την παρουσία αρωματικών δακτυλίων στα αμινοξέα που συνθέτουν την πρωτεΐνη, Στη συνέχεια εξουδετερώνουμε το διάλυμα με καυστικό νάτριο 10% (προσθέτουμε σημαντική ποσότητα, ανάλογα με το πόσο νιτρικό οξύ είχε προηγουμένως προστεθεί) μέχρι να σχηματισθεί πορτοκαλί ίζημα.

Έλεγχος καζεΐνης ως πρωτεϊνικού υλικού (3 από 3) (γ) αντίδραση διουρίας : μια μικρή ποσότητα (10mg) από την καζεΐνη που παραλήφθηκε κατά την προηγούμενη διαδικασία διαλύεται σε 1 ml απιονισμένου νερού και προσθέτουμε 5 σταγόνες NaOH 10% και 2 σταγόνες αραιού διαλύματος CuSO4 υπό συνεχή ανάδευση, Η παρατήρηση πορφυρο-ιώδους προϊόντος υποδηλώνει την παρουσία πρωτεΐνης.

Φύλλο παρουσίασης αποτελεσμάτων Απομόνωση της καζεΐνης από το γάλα. Σκοπός εργασίας Δοκιμασία Παρατήρηση Αιτιολόγηση/ συμπέρασμα 1. προσθήκη πυκνού οξικού οξέος   2. προσθήκη αιθανόλης 3. προσθήκη αιθανόλης-αιθέρα 4. ζύγιση και υπολογισμός της % απόδοσης

Φύλλο παρουσίασης αποτελεσμάτων Χαρακτηριστικές αντιδράσεις καζεΐνης Δοκιμασία Παρατηρήσεις Συμπεράσματα Αντίδραση νινυδρίνης   Αντίδραση διουρίας Ξανθοπρωτεϊνική αντίδραση (προσθήκη πυκνού νιτρικού οξέος)

Ερωτήσεις (α) Από τον κατάλογο των αμινοξέων της άσκησης 7 (Χημικές αντιδράσεις πρωτεϊνών), βρείτε: ποια αμινοξέα έχουν περισσότερες από μια αμινομάδες και ποια έχουν περισσότερες από μία ομάδες καρβοξυλικού οξέος, (β) Πώς περιμένετε να συμπεριφέρονται αυτές οι ομάδες στο ισοηλεκτρικό σημείο των αμινοξέων και κατά συνέπεια στις πρωτεΐνες όπου συμμετέχουν;

Βιβλιογραφία McMurry John, Οργανική Χημεία, Πανεπιστημιακές Εκδόσεις Κρήτης, 2012 (ενιαίος τόμος), D. L. Nelson, M. Cox, Lehninger Principles of Biochemistry, 4th Edition, W. Freeman and Company, 2004, J. M. Berg, J. L. Tymoczko, L. Stryer, Biochemistry, 5th ed., W. Freeman and Company, 2002, Isolation of casein from milk, Austin Peay State University Department of Chemistry, 2011, Isolation and Identification of Casein From Milk Course Notes, D. Spurlock, Indiana University Southeast, 2013.

Τέλος Ενότητας

Σημειώματα

Σημείωμα Αναφοράς Copyright Τεχνολογικό Εκπαιδευτικό Ίδρυμα Αθήνας, Σταμάτης Μπογιατζής 2014. Σταμάτης Μπογιατζής. «Εργαστήριο Επιστήμης Υλικών ΙΙ. Ενότητα 8: Απομόνωση της καζεΐνης από το γάλα και ιδιότητές της». Έκδοση: 1.0. Αθήνα 2014. Διαθέσιμο από τη δικτυακή διεύθυνση: ocp.teiath.gr.

Σημείωμα Αδειοδότησης Το παρόν υλικό διατίθεται με τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Αναφορά, Μη Εμπορική Χρήση Παρόμοια Διανομή 4.0 [1] ή μεταγενέστερη, Διεθνής Έκδοση. Εξαιρούνται τα αυτοτελή έργα τρίτων π.χ. φωτογραφίες, διαγράμματα κ.λ.π., τα οποία εμπεριέχονται σε αυτό. Οι όροι χρήσης των έργων τρίτων επεξηγούνται στη διαφάνεια «Επεξήγηση όρων χρήσης έργων τρίτων». Τα έργα για τα οποία έχει ζητηθεί άδεια αναφέρονται στο «Σημείωμα Χρήσης Έργων Τρίτων». [1] http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/ Ως Μη Εμπορική ορίζεται η χρήση: που δεν περιλαμβάνει άμεσο ή έμμεσο οικονομικό όφελος από την χρήση του έργου, για το διανομέα του έργου και αδειοδόχο που δεν περιλαμβάνει οικονομική συναλλαγή ως προϋπόθεση για τη χρήση ή πρόσβαση στο έργο που δεν προσπορίζει στο διανομέα του έργου και αδειοδόχο έμμεσο οικονομικό όφελος (π.χ. διαφημίσεις) από την προβολή του έργου σε διαδικτυακό τόπο Ο δικαιούχος μπορεί να παρέχει στον αδειοδόχο ξεχωριστή άδεια να χρησιμοποιεί το έργο για εμπορική χρήση, εφόσον αυτό του ζητηθεί.

Επεξήγηση όρων χρήσης έργων τρίτων Δεν επιτρέπεται η επαναχρησιμοποίηση του έργου, παρά μόνο εάν ζητηθεί εκ νέου άδεια από το δημιουργό. © διαθέσιμο με άδεια CC-BY Επιτρέπεται η επαναχρησιμοποίηση του έργου και η δημιουργία παραγώγων αυτού με απλή αναφορά του δημιουργού. διαθέσιμο με άδεια CC-BY-SA Επιτρέπεται η επαναχρησιμοποίηση του έργου με αναφορά του δημιουργού, και διάθεση του έργου ή του παράγωγου αυτού με την ίδια άδεια. διαθέσιμο με άδεια CC-BY-ND Επιτρέπεται η επαναχρησιμοποίηση του έργου με αναφορά του δημιουργού. Δεν επιτρέπεται η δημιουργία παραγώγων του έργου. διαθέσιμο με άδεια CC-BY-NC Επιτρέπεται η επαναχρησιμοποίηση του έργου με αναφορά του δημιουργού. Δεν επιτρέπεται η εμπορική χρήση του έργου. Επιτρέπεται η επαναχρησιμοποίηση του έργου με αναφορά του δημιουργού και διάθεση του έργου ή του παράγωγου αυτού με την ίδια άδεια. Δεν επιτρέπεται η εμπορική χρήση του έργου. διαθέσιμο με άδεια CC-BY-NC-SA διαθέσιμο με άδεια CC-BY-NC-ND Επιτρέπεται η επαναχρησιμοποίηση του έργου με αναφορά του δημιουργού. Δεν επιτρέπεται η εμπορική χρήση του έργου και η δημιουργία παραγώγων του. διαθέσιμο με άδεια CC0 Public Domain Επιτρέπεται η επαναχρησιμοποίηση του έργου, η δημιουργία παραγώγων αυτού και η εμπορική του χρήση, χωρίς αναφορά του δημιουργού. Επιτρέπεται η επαναχρησιμοποίηση του έργου, η δημιουργία παραγώγων αυτού και η εμπορική του χρήση, χωρίς αναφορά του δημιουργού. διαθέσιμο ως κοινό κτήμα χωρίς σήμανση Συνήθως δεν επιτρέπεται η επαναχρησιμοποίηση του έργου.

Διατήρηση Σημειωμάτων Οποιαδήποτε αναπαραγωγή ή διασκευή του υλικού θα πρέπει να συμπεριλαμβάνει: το Σημείωμα Αναφοράς το Σημείωμα Αδειοδότησης τη δήλωση Διατήρησης Σημειωμάτων το Σημείωμα Χρήσης Έργων Τρίτων (εφόσον υπάρχει) μαζί με τους συνοδευόμενους υπερσυνδέσμους.

Σημείωμα Χρήσης Έργων Τρίτων Το Έργο αυτό κάνει χρήση περιεχομένου από τα ακόλουθα έργα: Όλες οι εικόνες και χημικοί τύποι:© Σταμάτης Χ. Μπογιατζής (εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά)

Χρηματοδότηση Το παρόν εκπαιδευτικό υλικό έχει αναπτυχθεί στo πλαίσιo του εκπαιδευτικού έργου του διδάσκοντα. Το έργο «Ανοικτά Ακαδημαϊκά Μαθήματα στο ΤΕΙ Αθήνας» έχει χρηματοδοτήσει μόνο την αναδιαμόρφωση του εκπαιδευτικού υλικού. Το έργο υλοποιείται στο πλαίσιο του Επιχειρησιακού Προγράμματος «Εκπαίδευση και Δια Βίου Μάθηση» και συγχρηματοδοτείται από την Ευρωπαϊκή Ένωση (Ευρωπαϊκό Κοινωνικό Ταμείο) και από εθνικούς πόρους.