ΣΥΓΚΡΙΣΗ ΜΕΜΒΡΑΝΙΚΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΣΤΑ ΓΟΝΙΔΙΩΜΑΤΑ ΤΩΝ ΘΕΤΙΚΩΝ ΚΑΙ ΑΡΝΗΤΙΚΩΝ ΚΑΤΑ GRAM ΒΑΚΤΗΡΙΩΝ Παπανικολοπούλου, Β.Π., Τσιρίγος, Κ.Δ., Μπάγκος, Π.Γ. και Χαμόδρακας, Σ.Ι. Τομέας Βιολογίας Κυττάρου και Βιοφυσικής, Τμήμα Βιολογίας, Πανεπιστήμιο Αθηνών, Αθήνα ΕΙΣΑΓΩΓΗ Οι μεμβρανικές πρωτεΐνες προσδίδουν στη μεμβράνη τις χαρακτηριστικές της λειτουργίες. Οι πρωτεΐνες αυτές κυρίως ελέγχουν την είσοδο-έξοδο ουσιών και είναι γνωστές ως μεταφορείς, αντλίες, κανάλια ή πορίνες. Άλλες λειτουργούν ως υποδοχείς, ένζυμα ή δομικές πρωτεΐνες. Οι μεμβρανικές πρωτεΐνες διακρίνονται σε περιφερειακές, σε διαμεμβρανικές και σε λιπο- συνδεόμενες. Οι διαμεμβρανικές πρωτεΐνες, αποτελούν περίπου το 25-30% όλων των πλήρως προσδιορισμένων πρωτεομάτων και επιτελούν μια σειρά από βιολογικά σημαντικές λειτουργίες. Η πολυπληθέστερη ομάδα αυτών, είναι οι α-ελικοειδείς διαμεμβρανικές πρωτεΐνες οι οποίες διαπερνούν τη λιπιδική διπλοστιβάδα με τη μορφή υδρόφοβων α-ελίκων. Για την πρόγνωση της δομής και της τοπολογίας των διαμεμβρανικών πρωτεϊνών έχουν αναπτυχθεί μια σειρά από υπολογιστικές τεχνικές, των οποίων η λειτουργία βασίζεται σε Νευρωνικά Δίκτυα, σε στατιστικές αναλύσεις ή σε Hidden Markov Μodels. Εικόνα 1: Δομή κυτοπλασματικής μεμβράνης Εικόνα 2: α-ελικοειδείς διαμεμβρανικές πρωτεΐνες ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Αντικείμενο μελέτης μας αποτέλεσαν οι διαμεμβρανικές πρωτεΐνες της εσωτερικής (κυτταρικής) μεμβράνης των αρνητικών αλλά και των θετικών κατά Gram βακτηρίων. Για την ανάλυση 194 πλήρως προσδιορισμένων βακτηριακών γονιδιωμάτων (129 αρνητικών, 65 θετικών κατά Gram) χρησιμοποιήθηκαν οι αλγόριθμοι πρόγνωσης: PRED-CLASS, MEMSAT, HMMTOP και PrediSi. PrediSi 1 : Prediction of Signal peptides. Το πρόγραμμα αυτό είναι ένα νέο εργαλείο για την πρόγνωση των signal-peptide στις αμινοξικές ακολουθίες των βακτηρίων και των ευκαρυωτικών οργανισμών. Η μέθοδος που χρησιμοποιείται βασίζεται σε position specific weight matrix, o οποίος λαμβάνει υπόψιν τις συχνότητες των αμινοξέων σε όλες τις πρωτεΐνες. PRED-CLASS 2 : Πρόγραμμα που κατηγοριοποιεί τις πρωτεΐνες με βάση την πληροφορία που περιέχεται στην αμινοξική τους ακολουθία σε transmembrane, fibrous, globular και mixed. MEMSAT 3 : Πρόγραμμα που εφαρμόζει μια μέθοδο για την πρόγνωση της δευτεροταγούς δομής και τοπολογίας των α-ελικοειδών διαμεμβρανικών πρωτεϊνών και βασίζεται στην αναγνώριση τοπολογικών μοντέλων. Η μέθοδος αυτή χρησιμοποιεί στατιστικούς πίνακες που προέρχονται από δεδομένα μεμβρανικών πρωτεϊνών καλά προσδιορισμένων και έναν αλγόριθμο δυναμικού προγραμματισμού που αναγνωρίζει την τοπολογία των μεμβρανικών πρωτεϊνών. HMMTOP 4 : Είναι μια μέθοδος που βασιζόμενη στο Hidden Markov Model κάνει πρόγνωση της θέσης και της ύπαρξης των διαμεμβρανικών ελίκων των διαμεμβρανικών πρωτεϊνών. Έτσι μας δίνει τη θέση ( in or out ), τον αριθμό και το ακριβές σημείο των διαμεμβρανικών τμημάτων. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 1 Hiller K, Grote A, Scheer M, Munch R, Jahn D. PrediSi: prediction of signal peptides and their cleavage positions. Nucleic Acids Research, 2004; Vol.32, Web Server issue W375-W Pasquier C, Promponas VJ, Hamodrakas SJ. PRED-CLASS: Cascading Neural Networks for Generalized Protein Classification and Genome-Wide Applications. Proteins 2001; 44: Jones DT, Taylor WR, Thornton JM. A Model Recognition Approach to the Prediction of All-Helical Membrane Protein Structure and Topology Biochemistry 1994; 33, Tusnady, G.E. and Simon, I. The HMMTOP transmembrane topology prediction server. Bioinformatics 2001; Vol.17 no.9, Stevens T, Arkin I. The effect of nucleotide bias upon the composition and prediction of transmembrane helices. Protein Science 2000; 9: PROTEIN NUMBER % NUMBER TM Αριθμός ΤΜ συναρτήσει του % ποσοστού του αριθμού των πρωτεϊνών ΠΟΣΟΣΤΟ Α.Α. Αμινοξικά κατάλοιπα (Α.Α.) συναρτήσει του ποσοστού των Α.Α. GC / AT VA / FI Λόγος GC / AT στα γονιδιώματα συναρτήσει του λόγου VA / FI στα ΤΜ % (F+I) % (V+A) % ποσοστό βαλίνης (V) και αλανίνης (Α) συναρτήσει του % ποσοστού φαινυλαλανίνης (F) και ισολευκίνης (Ι) LENGTH TM PROTEIN NUMBER % LENGTH TM Ιστόγραμμα του μήκους των διαμεμβρανικών τμημάτων συναρτήσει του % ποσοστού του αριθμού των πρωτεϊνών για το HMMTOP και MEMSAT A.A.ΚΩΔΙΚΟΝΙΑ ΑlaGCX PheTTC/T IleATA/C/T ValGTX ΣΥΖΗΤΗΣΗ Από την ανάλυση των βακτηριακών πρωτεομάτων και την παρατήρηση των γραφικών παραστάσεων, ένα σημαντικό εύρημα είναι ο εντοπισμός μιας σημαντικής διαφοράς στην κατανομή των πρωτεϊνών με διαφορετικό αριθμό διαμεμβρανικών τμημάτων. Συγκεκριμένα, βρέθηκε ότι στα θετικά κατά Gram βακτήρια, οι πρωτεΐνες με 6 διαμεμβρανικά τμήματα είναι σημαντικά περισσότερες από ότι στα αρνητικά κατά Gram. Το γεγονός αυτό πρέπει να διερευνηθεί καθώς 6 διαμεμβρανικά τμήματα απαντώνται σε διάφορες οικογένειες διαμεμβρανικών μεταφορέων, όπως: - Aquaporins, - ATP – binding cassette [ABC] transporters, - Protein-export membrane proteins (secD, secF), οι οποίες σχετίζονται με μεταφορά ουσιών διαμέσω της μεμβράνης από τα βακτήρια. Γενικότερες διαφορές σε άλλες παραμέτρους (μήκη διαμεμβρανικών τμημάτων, κατανομές αμινοξέων κλπ) δεν παρατηρήθηκαν. Παρατηρήθηκε τέλος, μια διαφορετική συσχέτιση του λόγου των αμινοξέων (V+A)/(F+I) στα διαμεμβρανικά τμήματα, με το λόγο των νουκλεοτιδίων (G+C)/(A+T) σε ολόκληρο το γονιδίωμα. Οι διαφορές αυτές πρέπει να ερευνηθούν περαιτέρω, αλλά πιθανόν να οφείλονται στη διαφορετική σύσταση των μεμβρανών σε λιπίδια και κατ’ επέκταση σε διαφορές στην υδροφοβικότητα της μεμβράνης. GRAM + GRAM – ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 5 NO MEMBRANE PROTEINS (127710) 75% MEMBRANE PROTEINS (>=2TM) (29795) 18% MEMBRANE PROTEINS (<2TM) (11927) 7% NO MEMBRANE PROTEINS (315724) 77% MEMBRANE PROTEINS (<2TM) (31457) 8% MEMBRANE PROTEINS (>=2TM) (62247) 15%