MIKROBIOLOŠKO ISPITIVANJE MLEKA I PROIZVODA OD MLEKA dr Vera Katić, redovni profesor Univerzitet u Beogradu, Fakultet veterinarske medicine

Kriterijumi bezbednosti hrane Kategorija hrane Mikroorganizmi/ njihovi toksini, metaboliti Plan uzorkovanja Granične vrednosti Referentna metoda ispitivanja Faza u kojoj se kriterijum primenjuje n c m М 1.1 Hrana spremna za konzumiranje koja podržava rast L.monocytogenes Listeria monocytogenes 5 100 cfu/g EN ISO 11290-2 Proizvod u prometu tokom njegovog roka upotrebe. Ne sme biti u 25 g EN ISO 11290-1 Pre nego što hrana prestane da bude pod neposrednom kontrolom subjekta koji je proizveo 1.2  Hrana spremna za konzumiranje koja ne podržava rast L.monocytogenes (4) (8) 100 cfu/ g

Primeri (lista nije zatvorena) Hrana spremna za konzumiranje (proizvodi od mleka) Kriterijum broj Mikroorganizam i kategorija hrane Primeri (lista nije zatvorena) 1.1 L. monocytogenes u hrani spremnoj za konzumiranje koja podržava njen rast Meki sir (sirevi sa sekundarnim zrenjem: bri, gorgonzola, kamambert idr). 1.2 L. monocytogenes u hrani spremnoj za konzumiranje koja ne podržava njen rast Sladoled; Fermentisani proizvodi od mleka; Tvrdi sir; Proizvodi sa rokom upotrebe kraćim od 5 dana: npr. Pasterizovano mleko.

Kriterijumi bezbednosti hrane Poglavlje 1 tačka 1.10; 1.11; 1.12 Kategorija hrane Mikroorganizmi/ njihovi toksini, metaboliti Plan uzorkovanja Granične vrednosti Referentna metoda ispitivanja Faza u kojoj se kriterijum primenjuje n c m M Sirevi, maslac I pavlaka proizvedeni od sirovog mleka ili mleka obrađenog tem. nižom od past. Salmonella 5 Ne sme biti u 25g EN/ISO 6579 Proizvod u prometu tokom roka potrebe Mleko u prahu i surutka u prahu Proizvod u prometu tokom roka upotrebe Sladoled izuzimajući proizvode kod kojih proces proizvodnje ili sastav eliminišu rizik od salmonela

Kriterijumi bezbednosti hrane Poglavlje 1 tačka 1.20 Kategorija hrane Mikroorganizmi/ njihovi toksini, metaboliti Plan uzorkovanja Granične vrednosti Referentna metoda ispitivanja Faza u kojoj se kriterijum primenjuje n c m M Sirevi, mleko u prahu i surutka u prahu kako je navedeno u kriterijumu za koagulaza pozitivne stafilokoke u poglavlju 2.2. ovog priloga Stafilokokni enterotoksini 5 Ne sme biti u 25g Evropska skrining metoda, CRL za mleko Proizvod u prometu tokom roka potrebe

Kriterijum higijene u procesu proizvodnje – Mleko i proizvodi od mleka (tačka 2.2.1) Kategorija hrane Mikroorganizmi/ mjihovi toksini, metaboliti Plan uzorko-vanja Granične vrednosti Referent.metoda isitivanja Faza u kojoj se kriterijum primenjuje Mera u slučaju nezadovojavajućih rezultata n c m M Pasterizo-vano mleko i drugi pasterizo-vani tečni proizvodi od mleka Enteroba-teriaceae  5 10 cfu/g ISO 21528-2 Kraj proizvodnog rocesa Provera efikasnosti toplotne obrade i sprečavanje ponovne kontaminacije

Kriterijum higijene u procesu proizvodnje – Mleko i proizvodi od mleka (tačka 2.2.2) Kategorija hrane Mikroorganizmi mjihovi toksini, metaboliti Plan uzorko-vanja Granične vrednosti Referent. metoda isitivanja Faza u kojoj se kriterijum primenjuje Mera u slučaju nezadovojava-jućih rezultata n c m M Sirevi proizvedeni od mleka ili surutke koji su obrađeni toplotom E. coli 5 2 100 cfu/g 1000 cfu/g ISO 16649-1 ili 16649-2 Za vreme proizvodnog procesa, u vreme kada se očekuje da će broj kolonija E. coli biti najveći Poboljšanje higijene proizvodnje i izbora sirovina.

Kriterijum higijene u procesu proizvodnje – Mleko i proizvodi od mleka (tačka 2.2.3) Kategorija hrane Mikroor-ganizmi/ mjihovi toksini, metaboliti Plan uzorko-vanja Granične vrednosti Referent. metoda isitivanja Faza u kojoj se kriterijum primenjuje Mera u slučaju nezadovojavajućih rezultata n c m M Sirevi proizvedeni od sirovog mleka Koagulaza pozitivne stafilokoke 5 2 104 cfu/g 105 cfu/g ISO 6888-1 ili 6888-2 Za vreme proizvodnog procesa, u vreme kada se očekuje da će broj stafilokoka biti najveći Poboljšanje higijene proizvodnje i izbora sirovina. Ako se utvrde vrednosti >105 cfu/g, ta proizvodna partrija sira mora se ispitati na prisustvo stafilokoknih enterotoksina

Kriterijum higijene u procesu proizvodnje – Mleko i proizvodi od mleka (tačka 2.2.4) Kategorija hrane Mikroor-ganizmi/ mjihovi toksini, metaboliti Plan uzork-ovanja Granične vrednosti Referent metoda isitivanja Faza u kojoj se kriterijum primenjuje Mera u slučaju nezadovojavajućih rezultata n c m M Sirevi proizvedeni od mleka koje je obrađeno toplotom na temperaturi nižoj od temperature pasterizacije, sirevi sa zrenjem proizvedeni od pasterizovanog mleka ili surutke, ili od mleka ili surutke obrađenih jačim režimom toplotne obrade Koagulaza pozitivne stafilokoke 5 2 100 cfu/g 1000 cfu/g ISO 6882-1 ili 6882-2 Za vreme proizvodnog procesa, u vreme kada se očekuje da će broj stafilokoka biti najveći Poboljšanje higijene proizvodnje i izbora sirovina. Ako se utvrde vrednosti >105 cfu/g, ta proizvodna partrija sira mora se ispitati na prisustvo stafilokoknih enterotoksina

Primer:Kriterijum za hranu u kojoj se određuje broj koagulaza pozitivnih stafilokoka (tačka 2.2.5.) Kategorija hrane Mikroor-ganizmi/ mjihovi toksini, metaboliti Plan uzorko-vanja Granične vrednosti Referent. metoda isitivanja Faza u kojoj se kriterijum primenjuje Mera u slučaju nezadovojavajućih rezultata n c m M Meki sirevi bez zrenja (sveži sirevi) proizvedeni od mleka ili surutke koji su pasterizovani ili obrađeni jačim režimom toplote Koagulaza pozitivne stafilokoke 5 2 10 cfu/g 100 cfu/g ISO 6888-1 ili 6888-2 Kraj proizvodnog procesa Poboljšanje higijene proizvodnje. Ako se utvrde vrednosti >105 cfu/g, ta proizvodna partrija sira mora se ispitati na prisustvo stafilokoknih enterotoksina

Kriterijum higijene u procesu proizvodnje – Mleko i proizvodi od mleka (tačka 2.2.6) Kategorija hrane Mikroor-ganizmi/ mjihovi toksini, metaboliti Plan uzorko-vanja Granične vrednosti Referent. metoda isitivanja Faza u kojoj se kriterijum primenjuje Mera u slučaju nezadovojavajućih rezultata n c m M Maslac i pavlaka proizvedeni od sirovog mleka ili mleka koje je obrađeno toplotom na temperaturi nižoj od temperature pasterizacije E. coli 5 2 10 cfu/g 100 cfu/g ISO 16649-1 ili 16649-2 Kraj proizvodnog procesa Poboljšanje higijene proizvodnje i izbora sirovina.

Kriterijum higijene u procesu proizvodnje – Mleko i proizvodi od mleka (tačka 2.2.7) Kategorija hrane Mikroor-ganizmi/ mjihovi toksini, metaboliti Plan uzorko-vanja Granične vrednosti Referent. metoda isitivanja Faza u kojoj se kriterijum primenjuje Mera u slučaju nezadovojavajućih rezultata n c m M Mleko u prahu i surutka u prahu Enteroba-teriaceae  5 10 cfu/g ISO 21528-1 Kraj proizvodnog rocesa Provera efikasnosti toplotne obrade i sprečavanje ponovne kontaminacije Koagulazapozitivne stafilokoke 2 100 cfu/g EN ISO 6888-1 Ili ISO 6888-2 Poboljšanje higijene proizvodnje. Ako se utvrde vrednosti >105 cfu/g, ta proizvodna partrija sira mora se ispitati na prisustvo stafilokoknih enterotoksina

Tumačenje rezultata primera Kriterijum 2. 2. 7. iz Priloga 1 Tumačenje rezultata primera Kriterijum 2.2.7. iz Priloga 1., Poglavlja 2. Zadovoljavajući: Ako su sve dobijene vrednosti za Enterobateriaceae u svih pet jedinica uzorka manje od 10 cfu/g (<m) i, ako je broj koagulaza pozitivnih stafilokoka u svih pet ispitivanih jedinica uzorka manji od 10 cfu/g. Prihvatljiv: Ako su maksimalno 2 (c) od 5 (n) dobijenih vrednosti za koagulaza pozitivne stafilokoke između 10 i 100 cfu/g (između m i M), a ostale dobijene vrednosti manje ili jednake 10 cfu/g (≤m). Nezadovoljavajuć: Ako je jedna ili više dobijenih vrednosti za koagulaza pozitivne stafilokoke veća od 100 cfu/g ili (>M), ili ako je u više od 2 (c) od ispitivanih 5 (n) jedinica vrednost između 10 i 100 cfu/g (između m i M).

Kriterijum higijene u procesu proizvodnje – Mleko i proizvodi od mleka (tačka 2.2.8) Kategorija hrane Mikroorganizmi/ mjihovi toksini, metaboliti Plan uzorko-vanja Granične vrednosti Referent. metoda isitivanja Faza u kojoj se kriterijum primenjuje Mera u slučaju nezadovojava-jućih rezultata n c m M Sladoled i smrznuti mlečni dezerti Enterobacteriaceae  5 2 10 cfu/g ISO 21528-2 Kraj proizvodnog rocesa Poboljšanje higijene proizvodnje

Metode ispitivanja Za ispitivanje se moraju koristiti referentne metode propisane u okviru mikrobioloških kriterijuma. Prihvatljiva je primena alternativnih metoda ispitivanja: ukoliko se validacija datog metoda vrši u odnosu na referenti metod naveden u Pravilniku (Sl. glasnik RS broj 72/10) ili ukoliko subjekt u poslovanju hranom primenjuje metod koji je sertifikovan od treće strane u skladu sa protokolom utvrđenim EN/ISO standardom 16140 ili nekim drugim međunarodno priznatim protokolom, a njihovo korišćenje odobreno od strane Ministarstva nadležnog za poslove poljoprivrede.

Izolovanje i identifikacija Listeria monocytogenes iz hrane i hrane za životinje ISO – 11290-1-2004 25 g/ml uzorka za ispitivanje u 225 ml ½ Frejzer bujona 24 h na 30 C Omčicom po Površini ALOA 24-28 h na 37C 0,1 ml u 10 ml Frejzer bujona 48 h na 37 C Pet tipičnih kolonija (zeleno-plave kolonije) presejava se na triptone soya yeast extract agar (TSYEA) -Inkubacija 18-24 h na 37C. Identifikacija: Gram (+), katalaza (+), pokretljivost (+), CAMP (+), β-hemoliza (+), glukoza (+), ramnoza (+), ksiloza (-)

Listeria monocytogenes EN ISO 11290 - 2:2000 Izolacija Revitalizacija 1 čas i Razređenje 1:10 0,1 mL Puferisana Peptonska voda Ili osnovna podloga za ½ bujon po Frejzeru ALOA 48 h- 37°C TSYEA 18-24h na 37°C Karakterističan Rast na ALOA podlozi

Rast L. monocytogenes na ALOA podlozi (Agar Listeria according to Ottaviani and Agosti)

Listeria monocytogenes Potvrda na osnovu biohemijskih osobina Bojenje po Gramu Pokretljivost Metod 1 Inokulisati TSYEB 242h pri 30°C Mikroskopiranje Sitni štapići, slabo pokretni Metod 2 Inokulisati agar za pokretljivost 48 4h pri 30°C Ispitati rast u podlozi rast u vidu kišobrana

Test pokretljivosti

Listeria monocytogenes Potvrda na osnovu biohemijskih osobina test -hemolize na krvnom agaru (ovčija krv) Sposobnost da lizira eritrocite Metod 2 Zasejati BHI bujon 242h –48 pri 37°C Mikrotitarske ploče: 6x100 l eritrocita ovna+2x100 l bakterijske kulture+2x pozitivna kontrola +2x negativna kontrola 30-45 min pri 37°C i 2h pri 5 °C Pozitivna reakcija: homogeno crveno Metod 1 Zasejati krvni agar 242h pri 37°C Uska jasna zona

Listeria monocytogenes – CAMP test

Izolacija i identifikacija L. monocytogenes različite vrste unutar roda Listeria se razlikuju određivanjem biohemijskih osobina brzi test-API Listeria - uključuje određivanje 10 najvažnijih

Detekcija Salmonella - ISO Standard 6579 25g/ml ispitivanog uzorka u 225ml/g PPV 16-20 h pri 35-37C 1. dan 2.dan 0,1 ml iz PPV u 10 ml RVS bujona 24 h/ 41,5 C 1 ml iz PPV u 10 ml MKTTn bujona 24 h pri 37 C 3. dan XLD agar 24 h/35-37C 1 ploča 14cm 2 ploče 9 cm Bilo koji drugi agar za Salmonella 1 ploča 14cm 2 ploče 9 cm XLD agar 24 h/35-37C 1 ploča 14cm 2 ploče 9 cm Bilo koji drugi agar za Salmonella 1 ploča 14cm 2 ploče 9 cm 4. dan Očitavanje rezultata-rast na hranljivim podlogama Rappaport-Vassiliadis podloga sa sojom (RVS bujon); Muller-Kauffmann tetrationat/ novobiocin bujon (MKTTn bujon); ksiloza lizin deoksiholat agar (XLD agar).

Izgled kolonija Salmonella spp. na XLD agaru

Salmonella spp. EN-ISO 6579 : 2003 Pet tipičnih kolonija na hranljivi agar/ inkubacija 243 na 37 C Biohemijska Potvrda + TSI agar + Dekarboksilacija lizina - Urea agar - Beta dekaboksilaza + Voges Proskauer - Indol Serološka potvrda

Metode za odredjivanje broja koagulaza pozitivnih stafilokoka u hrani Mikrobiologija hrane i hrane za životinje — Horizontalna metoda za određivanje broja koagulaza pozitivnih stafilokoka (Staphylococcus aureus i druge vrste) — Deo 1: Tehnika agara po Berd-Parkeru (Baird-Parker) (EN ISO 6888-1:1999 + A1:2003, IDT; ISO 6888-1:1999 + Amd 1:2003). Mikrobiologija hrane i hrane za životinje — Horizontalna metoda za određivanje broja koagulaza pozitivnih stafilokoka (Staphylococcus aureus i druge vrste) — Deo 2: Tehnika agara sa plazmom kunića i fibrinogenom (EN ISO 6888-2:1999 + A1:2003, IDT; ISO 6888-2:1999 + Amd 1:2003). Mikrobiologija hrane i hrane za životinje — Horizontalna metoda za određivanje broja koagulaza pozitivnih stafilokoka (Staphylococcus aureus i druge vrste) — Deo 3: Otkrivanje i MPN tehnika za male brojeve (ISO 6888-3:2003).

Izolovanje Staphylococcus aureus EN ISO 6888-1:2000 0,1 mL 0,1 mL Koagulaza 37 1oC Do 24 Druge stafilokoke 0,1mL BHI 37  1oC – 24  2h Baird Parker agar 37  1°C – 24 -48h

Izgled kolonija koagulaza pozitivnih stafilokoka na Baird Parker podlozi

Rabbit Plasma Fibrinogen Agar Izolovanje Sraphylococcus aureus EN ISO 6888-2:2000 + - 1 mL 1 mL S. aureus Rabbit Plasma Fibrinogen Agar 35-37  1°C – 18- 24h

Izgled kolonija koagulaza pozitivnih stafilokoka na Rabbit Plasma Fibrinogen Agar podlozi

Identifikacija izolovata Staph. aureus Koagulaza test Preneti 5 sumnjivu koloniju u BHI- bujon 24 (±2)h/ 37˚C 0,1 ml bujonske kulture +0,3 ml plazme u sterilne epruvete Inkubacija pri 37˚C Rezultati se očitavaju posle 4-6h, 18 i 24 časa. Zasejava se pozitivna kontrola sa referentnim sojem sigurno koagulaza pozitivnim. Negativna kontrola je nezasejana plazma. Pozitivna reakcija u epruveti zasejanoj pozitivnim sojem i ispitivanim izolatom, a negativna reakcija (izostanak koagulacije plazme) očitava se kao koagulaza pozitivan soj.

Izolovanje Staph. aureus iz hrane na RPF (rabbit plasma in place of pig plazma) podlozi 1 ml iz decimalnog razblaženja se prelije sa 10 ml RPF podloge. Karakteristike RPF podloge Ne sadrži žumance jajeta. Ista osnova podloge kao i za BP sa kalijum teluritom. Bovini fibrinogen precipitacija Plazma stimuliše precipitaciju Inhibitor tripsina: prevenira razlaganje precipitata dejstvom tripsina (stvara ga S. aureus) Inkubacija 48(±4)h/ 37˚C; kolonije se broje posle 24 i 48 h Pozitivna reakcija: sjajne, sive, crne kolonije okružene precipitatom.

Izračunavanje broja koagulaza pozitivnih stafilokoka gde su: Ac broj tipičnih kolonija koje se podvrgavaju koagulaza ispitivanju; Anc broj atipičnih kolonija koje se podvrgavaju koagulaza ispitivanju; bc broj tipičnih kolonija za koje je pokazano da su koagulaza pozitivne; bnc broj atipičnih kolonija za koje je pokazano da su koagulaza pozitivne; cc ukupan broj tipičnih kolonija viđenih na ploči; cnc ukupan broj atipičnih kolonija viđenih na ploči.

Izračunavanje broja koagulaza pozitivnih stafilokoka a zbir kolonija koagulaza pozitivnih stafilokoknih identifikovanih na svim odabranim pločama; V zapremina inokuluma na svakoj ploči, u mililitrima; n1 broj ploča odabranih pri prvom razblaženju; n2 broj ploča odabranih pri drugom razblaženju; d stepen razblaženja koji odgovara prvom odabranom razblaženju (početna suspenzija je razblaženje).

Horizontalna metoda za otkrivanje i određivanje broja Enterobacteriaceae – Metoda brojanja kolonija SRPS ISO 21528-2 Potvrdni testovi Izolacija Uzorak 1ml 15 ml Oksidaza 20 g/ml Enterobacteriaceae 1 ml VRBG 180ml FR 242h-37C Hranljivi Agar 242h-37C Fermentacija Glukoze 242h-37C

Doda se x g dela uzorka za Horizontalna metoda za otkrivanje i određivanje broja Enterobacteriaceae Otkrivanje i odredjivanje broja MPN tehnikom SRPS ISO 21528-1 Doda se 1ml dela uzorka za Ispitivanje u 9ml PPV Uzorak Doda se x g dela uzorka za Ispitivanje u 9xml i PPV homogenizuje 10-1 3x10 ml 10-1 3x1 ml 10-2 3x1 ml E. 1 E. 2 E. 3 E. 1 E. 2 E. 3 E. 1 E. 2 E. 3 Bez dodataka Doda se 9ml PPV i promeša Inkubira se svih 9 inokulisanih epruveta na 37°C tokom 18  2 h Preseje se 1 ml kulture u 10 ml bujona za obogaćenje i inkubira 242 h na 37°C

Otkrivanje i odredjivanje broja MPN tehnikom SRPS ISO 21528-2 Horizontalna metoda za otkrivanje i određivanje broja Enterobacteriaceae Otkrivanje i odredjivanje broja MPN tehnikom SRPS ISO 21528-2 Nastavak predhodnog slajda Zaseje se ezom na površinu VRBG agara i inkubira 242 h na 37°C Izabere se pet karakterističnih kolonija i svaka zaseje na hranljivi agar (24 2 h pri 37 °C) Karakteristične kolonije su ružičaste do crvene ili purpurne sa zonom precipitirane žuči ili ne. Prisustvo Enterobacteriaceae se potvrđuje na osnovu: Oksidaza testa (-) Fermentacije glukoze (+) Za određivanje MPN koristi se tabela data u tačci 9.4 standarda ISO 7218.

Određivanje broja Escherichia coli Mikrobiologija prehrambenih proizvoda i hrane za životinje — Horizontalna metoda za određivanje broja β-glukuronidaza pozitivne Escherichia coli — Deo 1: Tehnika brojanja kolonija na 44 C pomoću membrana i 5-bromo-4-hloro-3-indolil-β-d-glukuronida (SRPS ISO 16649-1 ) Mikrobiologija prehrambenih proizvoda i hrane za životinje — Horizontalna metoda za određivanje broja β-glukuronidaza pozitivne Escherichia coli — Deo 2: Tehnika brojanja kolonija na 44 C pomoću 5-bromo-4-hloro-3-indolil-β-d-glukuronida (SRPS- ISO 16649-2 )

Escherichia coli EN – ISO 16649- 2:2001 Za određivanje  -glukuronidaza- pozitivnih E. coli pri 44 °C koristi se: 5-bromo-4- hloro-3- indolil – - D-glukuronid Plave: E. coli 1mL TBX 15mL TBX 1 mL Tryptone Bile X-glucuronide AGAR (TBX) 1824h - 44 °C Druge bakterije TBX

Izgled kolonija Escherichia coli na TBX agaru