TRANSKRIPCIJA

Sličnosti između transkripcije i replikacije TRANSKRIPCIJA je proces u kome se sintetiše molekul RNK na osnovu informacije sadržane u jednom delu DNK molekula koja služi kao matrica. Sličnosti između transkripcije i replikacije Hemijski i enzimatski slični procesi - tokom oba se vrši enzimatska sinteza polinukleotidnog lanca na osnovu informacije sadržane u DNK molekulu

Razlika između replikacije i transkripcije Transkripcijom se sintetiše RNK molekul RNK polimeraza ne zahteva prajmer U toku transkripcije kopira se samo deo jednog lanca DNK Sintetisana RNK ne ostaje sparena sa DNK matricom Transkripcijom se kopiraju delovi genoma više puta Učestalost grešaka tokom transkripcije iznosi 10-4 do 10-5 puta

Osnovni pojmovi transkripcije Matrični lanac ili lanac-matrica je lanc DNK koji se transkribuje Kodirajući lanac je lanac koji se ne transkribuje 5′ 3′ gen A gen B gen C gen D DNK 5’ 3’ RNK RNK transkript Lanac matrica ili “antisence” lanac Kodirajuća sekvenca ili “sence” lanac kodoni gen

Osnovni pojmovi transkripcije gen promotor 5′ 3′ -35 -10 +1 uzvodno nizvodno signal za terminaciju +1 - mesto početka transkripcije (TSP–Transcription Start Point) Pozicije nukleotida se obeležavaju sa predznakom minus (-) i plus (+) u odnosu na mesto početka transkripcije

Promotor - DNK sekvenca za koju se RNK polimeraza veže i inicira transkripciju Operon – skup gena koji se prepisuje sa istog promotora Operator – trasnkripcioni regulatorni region (cis regulatorni element) Trans regulatorni elementi

Struktura promotorskog regiona prokariota Jači promotori su oni koji imaju sekvencu sličniju konsenzusnoj Jačina promotora označava broj transkripata čija sinteza može biti inicirana u jedinici vremena Jačinu promotora određuje afinitet RNK polimeraze, efikasnost prelaska zatvorenog u otvoreni kompleks i brzina kojom RNK polimeraza napušta promotor Biološki smisao različite jačine promotora je u tome da neki geni moraju biti eksprimirani na višem nivou u odnosu na druge, i takvi geni obično imaju jake promotore T A T A A T Pribnovljev blok - 35 region Start transkripcije -10 baznih parova -25 baznih parova Sekvenca u okviru promotor regiona koju prepoznaje holoenzim RNK-polimeraze DNK 5’ 3’ T T G A C A Struktura promotorskog regiona eukariota RNK poli I prepoznaje samo jedan tip promotora, jer su geni koji kodiraju rRNK skoro identični za datu vrstu. RNK poli I su species specifične. RNK poli III kod gena za 5S rRNK prepoznaje promotore koji se nalaze nizvodno od starta transkripcije, dok kod drugih gena koje transkribuje ovaj enzim one su postavljene i uzvodno i nizvodno. 5’ 3’ GC blok DNK Start transkripcije 25-30 baznih parova 40 baznih parova TATA blok‏ Sekvenca u okviru promotor regiona koju prepoznaje RNK-polimeraza II

Enzimi transkripcije RNK polimeraze prokarioti imaju jednu eukarioti imaju tri označene kao: Pol I prepisuje gene za prekursore svih rRNK, osim 5S rRNK Pol II transkribuje gene koji kodiraju proteine i skoro sve gene za miRNK i snRNK Pol III prepisuje gene za tRNK, 5S rRNK, U6 snRNK, neke gene za miRNK i druge male nekodirajuće RNK Specifične RNK polimeraze ćelijskih organela

RNK polimeraza - prokariota je pentamer koji grade α2ββ′σ subjedinice kod prokariota RPB1, RPB2, RPB3, RPB11 i RPB6 subjedinice kod eukariota - RPB1 (RNA polymerase II subunit B1) σ subjedinica se odvaja od enzima nakon incijacije, određuje da se transkripcija inicira samo na promotorima može da započne sintezu polinukleotidnog lanca de novo sinteza RNK se vrši u 5′ 3′ smeru

RNK polimeraze podsećaju na rakova klešta Ručice rakovih klešta se predominantno sastoje od dve najveće subjedinice Aktivno mesto enzima se nalazi u udubljenju između ručica i sastoji se od regiona  i ’ subjedinica RNK polimeraze sadrže veći broj kanala koji omogućavaju da DNK, RNK i ribonukleotidi uđu i izađu iz aktivnog centra kanali aktivni centar

TRANSKRIPCIJA KOD PROKARIOTA

RNK molekuli Transportna RNK Ribozomalna RNK Akceptorski krak D petlja Antikodon Kodon Akceptorski krak D petlja Varijabilna petlja iRNK TΨC petlja Dihidrouridin - Inozin Ribotimidin - Pseudouridin Transportna RNK Velika subjedinica Mala tRNK/AK vezujuća mesta Katalitičko mesto Ribozomalna RNK antikodon vezana AK

Informaciona RNK  Prokariotska iRNK -policistronska -odmah podleže translaciji nema “kapu” na 5’ kraju nema poli-A rep na 3’ ima Šajn-Dalgarnov niz nema introna Eukariotska iRNK -monocistronska -post-transkripcione modifikacije pre translacije ima “kapu” na 5’ kraju ima poli-A- rep nema Šajn-Dalgarnov niz primarni transkript ima introna Gppp 5’ kapa AUG  5’-kraj 3’-kraj Šajn-Dalgarnov niz Start kodon Stop kodon AGGA UAA Kodirajući region pApApApApApA-OH Nekodirajići region

Inicijacija transkripcije RNK polimeraza Sigma faktor Pribnovljev blok - 35 sekvenca nukleotid od koga počinje transkripciaja +1 nukleotid sekvenca u okviru promotornog regiona koju prepoznaje RNK polimeraza “sense” lanac “ antisense” lanac Promoter

Elongacija transkripcije korektivna mehanizma: iRNK DNK početak sinteze i RNK TRANSKRIPCIJA RNK polimeraza odvajanje sigma faktora RNK polimeraza smer transkripcije RNK nukleotidi RNK polimeraza koristi dva korektivna mehanizma: Pirofosforilitički Hidrolitički 3’ kraj lanca Transkripcioni mehur DNK antisense

Terminacija transkripcije - Transkripcione terminacione sekvence imaju niz AT parova i neposred pre ovog niza palindromske sekvence koje su bogate G+C nukleotidima ρ zavisna terminacija transkripcije Terminacioni protein ( ρ protein)‏ prepoznaje terminacionu sekvencu na molekulu DNK, destabilizuje vezu polimeraze i matrice, polimeraza disosuje i transkripcija se završava.

Terminacija transkripcije ρ nezavisna terminacija transkripcije Stvaranje ukosnice na lancu RNK destabiliše vezu između polimeraze i matrice, polimeraza disosuje i transkripcija se završava

TRANSKRIPCIJA KOD EUKARIOTA

TRANSKRIPCIJA KOD EUKARIOTA Tri klase transkripcionih faktora učestvuju u vezivanja RNK Poli II i otpočinjaju transkripcije Generalni transkripcioni faktori Uzvodni trasnkripcioni faktori Inducibilni trasnkripcioni faktori U in vivo uslovima pored transkripcionih faktora učestvuju dodatni proteini medijator, transkripcioni aktivatori i proteini koji regulišu strukturu hromatina

Post-transkripcione modifikacije iRNK Primarni transkript (pre-RNK) je linearna kopija transkripcione jedinice i uglavnom predstavlja funkcionalno neaktivan molekul RNK. jedro transkripcija Modifikacije iRNK DNK pre-iRNK translacija ribozom polipeptid iRNK Tri vrste modifikacija pre-RNK: 1. adicija 5’ kape 2. adicija poli-A repa 3. isecanje introna povećava stabilnost iRNK olakšava inicijaciju translacije zaštita 3’-kraja od egzonukleaza olakšava transport iRNK u citoplazmu olakšava translaciju Pre-iRNK iRNK 5’ kapa Poli-A rep Introni se isecaju a egzoni spajaju u iRNK Egzon 5’ 3’ Intron Kodirajući segment

DODAVANJE ‘’KAPE’’ NA 5’ KRAJ pre-iRNK CH2 H O OH 3’ 7 H2N CH3 HN N P Baza 1 Baza 2 DODAVANJE ‘’KAPE’’ NA 5’ KRAJ pre-iRNK 5’ 7-metil G Trifosfatni most Dodaje se 7-metilguanozin Enzim koji katalizuje ovu reakciju je guanilil transferaza Dodavanje 5’ kape stabilizuje iRNK molekul Olakšava proces inicijacije translacije 3’

POLIADENILACIJA 3’ KRAJA pre-iRNK Kada se traskripcija završi, endonukleaza hidrolizuje primarni transkript u dužini od 15 nukleotida nizvodno od signala za poliadenilaciju, a to je AAUAAA Zatim, enzim polidenilatna polimeraza dodaje poli A rep na 3’ kraj transkripta ( od 20-50 A u zavisnosti od vrste) Uloga – zašita od delovanja egzonukleaza, olakšava transport zrelih iRNK iz jedra u citoplazmu i olakšava translaciju

KONCENZUS SEKVENCA SPOJA EUKARIOTSKIH pre-iRNK EGZON-INTRON EUKARIOTSKIH pre-iRNK 5’ 3’ A62 A77 G55 G100 U100 A60 A74 G84 U50 77-91 U C 11 N C78 A100 G100 5’ mesto obrade 3’ mesto obrade Egzon Intron pre-iRNK

MEHANIZAM ISECANJA INTRONA IZ pre-iRNK 5’-Egzon Intron 3’-Egzon OH 2’ pre-iRNK 5’ ApA pGpUp pCpUpRpApYp Ap G pGp 3’ 5’ mesto obrade 3’ mesto obrade 1 3’ pGp pCpUpRpApYp p U G Ap G Intron 5’-Egzon 3’-Egzon ( 2’, 5’ ) 5’ ApA OH 3’ +

+ + 2 Isečeni intron oblika omče Spojeni egzoni U G Ap G Intron 3’ pGp pCpUpRpApYp p U G Ap G Intron 5’-Egzon 3’-Egzon ( 2’, 5’ ) 5’ ApA OH 3’ + ( 2’, 5’ ) OH 3’ pCpUpRpApYp p U G Ap G 2 Mesto spajanja 5’-Egzon 3’-Egzon + 5’ ApA 3’ pGp Isečeni intron oblika omče Spojeni egzoni

REZIME pre-iRNK Spojeni egzoni Isečeni intron oblika omče 5’-Egzon OH 2’ 5’ ApA pre-iRNK pGpUp pCpUpRpApYp Ap G 3’ pGp 5’ mesto obrade 3’ mesto obrade ( 2’, 5’ ) OH 3’ pCpUpRpApYp p U G Ap G 5’-Egzon 3’-Egzon Spojeni egzoni Isečeni intron oblika omče

Održavanje genoma Ekspresija genoma Osnovni procesi odgovorni za održavanje genoma su: Replikacija DNK Reparacija DNK Rekombinacija Ekspresija genoma Osnovni procesi odgovorni za ekspresiju genoma su: Transkripcija RNK procesovanje (obrada preRNK, editovanje RNK) Translacija

Prostorni i vremenski odnosi ekspresije genoma kod prokariota i eukariota

GENETIČKI KOD

Kako se genetička informacija sadržana u DNK prevodi u strukturu proteina? Primarna struktura DNK - 4 nukleotida (A, G, C, T) Primarna struktura proteina - 20 aminokiselina Koliko nukleotida čini šifru za 1 AK? 42 = 16 (nedovoljno) 43 = 64 (previše) Da li se šifre čitaju sa ili bez preklapanja? F. Crick: delecioni i insercioni mutanti faga T4  šifra se sastoji od 3 nukleotida A T G C T T A G G T C A T C G A A A T T G G G C T …. A T G C T T A G T C A T C G A A A T T G G G C T ... X

Dešifrovanje genetičkog koda Bezćelijski (in vitro) sistem za sintezu proteina matrica proizvod poli-U poli-Phe poli-A poli-Lys poli-C poli-Pro … ….

Dešifrovanje genetičkog koda Marshall Nirenberg i Heinrich Matthaei - 1964

GENETIČKI KOD Univerzalan Izrođen Kodoni za određenu AK nisu nasumično raspoređeni Evolucija genetičkog koda je bila takva da su posledice mutacija što manje

Odstupanja od univerzalnog genetičkog koda Kodon Univerzalni kod Izuzetak Vrsta UGA STOP Trp Mycoplasma Spiroplasma mitohondrije mnogih vrsta CUG Leu Thr mitohondrije kvasca UAA, UAG Gln Acetabularia Tetrahymena Paramecium Cys Euplotes

Terminologija KODON – triplet nukleotida koji predstavlja šifru za pojedinačnu aminokiselinu. Genetički kod – skup svih kodona. ANTIKODON – triplet nukleotida na tRNK koji je komplementaran odgovarajućem kodonu na iRNK. Otvoren okvir čitanja – kontinuirani niz kodona u iRNK, koji počinje start kodonom i završava se stop kodonom, a prevodi se u niz aminokiselina u proteinu.

Postojanje tri različita okvira čitanja

Mutacije promena okvira čitanja (“frame shift” mutacije) f i n t i p i d e b o s n i z p u t g r m i m a t r n c a p j a o k r v X f i n t i p i d e b o s n i z p u t g r m i m a t r n c a p j a o k r v f i n t i p i d e b o s n i p u t g r m i m a t r n c a p j a o k r v

HVALA NA PAŽNJI