Metode sterilizacije (2. deo) Prof. dr Snežana Savić Katedra za farmaceutsku tehnologiju i kozmetologiju Univerzitet u Beogradu – Farmaceutski fakultet

Sterilizacija filtracijom (Ph Jug V, Ph. Eur. 8.0) Metod sterilizacije za rastvore ili tečnosti koji nisu dovoljno stabilni da bi podneli proces zagrevanja u autoklavu. Primenjuje se za: rastvore termolabilnih supstanci (antibiotici, steroidi, peptidi) velike količine tečnosti preparate koji se ne mogu sterilisati u finalnoj ambalaži gasove Sterilizacija filtracijom izvodi se pod aseptičnim uslovima odnosno ova dva postupka se kombinuju.

Sterilizacija filtracijom Zasniva se na mehaničkom odstranjivanju vegetativnih i sporogenih oblika MO i drugih stranih čestica filtriranjem kroz sterilne filtere sa odgovarajućom veličinom pora (0.22µm – bakteriološki filter) pod aseptičnim uslovima; virusi i mikoplazme se ne mogu zadržati na ovaj način. MO se odstranjuju sejanjem (ako je veličina MO veća od veličine pora filtera) ili adsorpcijom (fiksiranje MO u spletu poroznih kanala filtera/filtracionog medijuma, elektrostatičkim vezama). Sterilizacija filtracijom izvodi se pomoću različitih uređaja za filtraciju koji se sastoje od: nosača filtra sterilnog filtra (filtracioni medijum) uređaja za regulisanje pritiska (povišen ili snižen pritisak), preporučuje se povišen pritisak

Sterilizacija filtracijom Filtri za bakteriološku filtraciju: Porozni filtri od sinter stakla (izrađeni od specijalnog stakla, specijalnim postupkom /sinterovanja) Celulozne ploče Porcelanske sveće (neglazirani mikroporozni porcelan) Membranski filtri (u poslednjih 35 godina postali su metod izbora za sterilizaciju termolabilnih proizvoda).

Ph. Eur. 8.0

Membranski filt(e)ri Membranski filteri su tanki, jaki i polimerne strukture; trodimenzionalni sistemi debljine 0.125 - 150µm. Jake i homogene mikroporozne membrane napravljene od polimera (npr. celulozni estri – smeša acetata i nitrata). Veličina pora 0.025 do 14 µm (na 1 cm2 ~ 1 milion pora) Za bakteriološku filtraciju (sterilizacija filtracijom) – veličina pora 0.22 – 0.45µm. FDA – membranski filter pora 0.22 µm efikasno zadržava MO. Pseudomonas diminuta (Brevundimonas diminuta) – standard biološkog opterećenja za kvalifikaciju sterilišućih membranskih filtera. Proizvode se precipitacijom polimera iz lako isparljivog rastvarača na specijalnoj ploči od nerđajućeg čelika i evaporacijom rastvarača pod kontrolisnim uslovima; očvrsla masa se pere i suši, i eventualno tretira PAM-ovima da se učini hidrofilnom.

Karakteristike membranskih filtera Porozna struktura – pore zauzimaju 80-85% zapremine filtra; nepravilnog su oblika Broj pora po jedinici površine membrane se naziva GUSTINA PORA (108 do 109/cm2) Dijametar pora – srednja vrednost dijametra pora u filtru (0,1 - 5µm), ali može biti i manja Primena: reversna osmoza, nanofiltracija, ultrafiltracija, mikrofiltracija (fina prefiltracija, sterilizacija u aseptičnom postupku...) Debljina - 150µm, ojačane potpornim mrežicama – duplo deblja Hidrofilni (za vodene rastvore) ili hidrofobni (za nevodene rastvore)

Protok fluida kroz membranski filter 1) otpor filtra; 2) viskozitet rastvora; 3) ukupna površina filtra; 4) pritisak koji se primenjuje pri filtraciji Manji promer pora – sporija filtracija Veći viskozitet – sporija filtracija (veća površina, može se ostvariti namotavanjem – kapsule, kartridži, sveće) Povećanje razlike pritisaka!

MATERIJALI ZA IZRADU MEMBRANSKIH FILTERA Celulozni estri (celulozanitart i celulozaacetat) – inertni, namenjeni za vodene sisteme, mogu se autoklavirati Polivinilhlorid – otporan prema organskim rastvaračima i jakim bazama Polisulfoni – inertni, mogu se autoklavirati, namenjeni za filtraciju vodeni rastvori i rastvori proteina Teflon (politetrafluoretilen) – hidrofoban, otporan na sve agense Polivinildien-difluorid – kompatibilan sa većinom rastvora – vodeni rastvori, rastvori proteina Polikarbonati – inertni, mogu se autoklavirati, za vodene rastvore Poliamid (najlon) – hidrofilni, elastični, otporni, mogu se autoklavirati: Najlon 66 – koristi se za filtriranje vodenih farmaceutskih rastvora i za rastvarače Modifikovani Najlon 66 (hidroksilovan) za filtriranje rastvora proteina Pozitivno naelektrisan Najlon 66 – filtriranje vodenih rastvora, otklanjanje negativnih čestica: pirogena, virusa, bakterija.

Membranski filt(e)ri Vrsta vehikuluma koga treba sterilisati određuje izbor polimera. Membranski filtri sterilišu se zasićenom vodenom parom pod pritiskom ili gasnom sterilizacijom (etilen - oksid). Nedostaci: ograničen kapacitet filtracionog medijuma može doći do pucanja filtera (nepodesan postupak) preparat se može kontaminirati pri punjenju u finalnu ambalažu pre i posle filtracije filtar se mora ispitati na neoštećenost (validacija integriteta filtracionog medijuma).

TEHNIKA MEMBRANSKE FILTRACIJE Uređaji tipa kartridža i tipa diska Kartridž: unutrašnji, šuplji, perforirani cilindar, oko njega namotan, naboran membranski filter (povećanje površine) Često je prisutan i naboran predfilter – dubinski, vlaknasti filtracioni medijum Moguća primena velikih P; veliki kapacitet Disk: manji kapacitet, povećava se primenom višeslojnih membranskih filtera

Tip kapsule: nije potrebno instalirati na držač/kućište; slična unutrašnja konfiguracija kao tip kartridža Rad pod povišenim pritiskom ili vakuumom.

Validacija sterilne filtracije Izvodi se jer: Postoji mogućnost neuniformnosti proizvedenih filtera Mogući mehanički defekti u strukturi filtera Moguće hemijske interakcije između filtera (membrane) i proizvoda koji se filtrira Mogući defekti usled uticaja temperature i pritiska sterilizacije samih filtera ili visokog pritiska pri filtraciji Otpuštanje čestica filtera u rastvor koji se filtrira.

Aseptični postupak Mada nije pravi postupak sterilizacije, aseptični postupak se često koristi u pripremanju lekovitih preparata (magistralnih ili industrijskih/gotovih lekova) za koje postoji zahtev za sterilnošću. Radi se o proizvodima koji ne mogu da podnesu terminalne postupke sterilizacije, ali se izrađuju iz sterilnih polaznih supstanci i pune u sterilnu ambalažu. U takvim slučajevima sterilnost mora biti očuvana kontrolom radnog okruženja. PRIMENA KOMORA SA LAMINARNIM PROTOKOM VAZDUHA ILI BARIJERNIH TEHNOLOGIJA!

Aseptičan postupak - Ph Jug V i Ph Eur 8.0 Cilj aseptičnog postupka je da se obezbedi sterilnost preparata pri čemu je svaka komponenta preparata sterilisana jednom od prethodno navedenih metoda. To se postiže primenom uslova i opreme koji su dizajnirani tako da spreče kontaminaciju mikroorg. Aseptični postupak može da obuhvata punjenje/zatvaranje preparata, mešanje komponenti formulacije preparata, koje je praćeno punjenjem i pakovanjem pod aseptičnim uslovima. Da bi se u toku postupka održala sterilnost komponenata i preparata treba da se obrati pažnja na: Radni prostor Osoblje Kritične površine Sterilizaciju suda/zatvarača i postupke prenosa.

Ph. Eur. 8.0

Gde se izvodi izrada sterilnih lekovitih preparata aseptičnim postupkom? Aseptični postupak izvodi se u komori sa laminarnim protokom vazduha (" Laminar flow“), ili u čistim sobama (eng. clean rooms)

FILTRACIJA VAZDUHA

Komore sa laminarnim protokom vazduha Obezbeđuje se odgovarajuća čistoća vazduha klase 100* (u 0.03 m3 vazduha prisutno maksimalno 100 lebdećih čestica dimenzija 0.5 µm). Kretanje vazduha je potisno slojevito, bez turbulencije. Brzina strujanja vazduha u komori 0.2-0.5 m/s Vazduh koji dolazi u radni deo prolazi kroz predfiltracioni medijum, a potom kroz filtracioni medijum, tzv. HEPA-filter (High efficiancy Particulate Air – visoko efikasni filtri za čestice iz vazduha, uklanja 99.97% lebdećih čestica najmanje 0.3µm) * Stepen A – max 3500 čestica 0.5 µm/m3 vazduha, nijedna 5 µm, živih MO manje od 1

HEPA filtracioni medijum Sastoji se iz dva dela, koja su naizmenično raspoređeni: Staklena vlakna i azbest Naborana plastična ili aluminijumska folija Dodatak u komori – UV lampa, dodatna mera obezbeđenja

„Čista soba“ čistoće vazduha Klase 100 „Čista soba“ čistoće vazduha Klase 1000 „Čista soba“ čistoće vazduha Klase 10000

Aseptični postupak, praktično... Sve što je potrebno za izradu preparata unosi se u aseptičan prostor (komora ili soba), a zatim preparat izrađuje i puni u ambalažu (primarno pakovanje). Primenjuje se za: Farmaceutske preparate koji se ne mogu sterilisati u finalnom pakovanju (ambalaži) Suspenzije i emulzije za parenteralnu aplikaciju Neke koloidne i uljane rastvore

Gasna sterilizacija, Ph. Jug V Koristi se onda kada ne postoji druga mogućnost Bitno je da se obezbedi penetracija gasa i vlage u materijal koji se steriliše i da zatim usledi eliminacija gasa ispod nivoa koji bi mogao da izazove toksične efekte tokom primene preparata Kad god je moguće beleže se koncentracija gasa, relativna vlažnost, T i vreme trajanja postupka (na najmanje dostupnim mestima) Efikasnost sterilizacionog gasa proverava se pomoću odgovarajućeg biološkog indikatora Test na sterilnost pre izdavanja dozvole za puštanje u promet Primenjuje se za termolabilne materijale, ambalažu i pakovni materijal od plastike, gume, papira i vlakana

Ph. Eur. 8.0

Gasna sterilizacija Dve vrste agenasa: 1) oksidišući i 2) alkilirajući Isparljiva faza vodonik peroksida (H2O2) Etilenoksid i formaldehid ETILENOKSID – CH2 --- CH2 - ETO - Bezbojan gas, teži od vazduha, miris sličan etru; sterilišući efekat usled reakcije alkilovanja; aktivacija se vrši u prisustvu vodene pare, povišene T i koncentracije – ETO – toksičan, zapaljiv i eksplozivan (u smešama sa više od 3% vazduha) Meša se sa gasovima (npr. CO2) da se smanji mogućnost paljenja i eksplozije O Proces sterilizacije ETO u sterilizatorima sličnim autoklavu, koji mogu da podnesu vakuum ili povišeni P (smeše ETO i CO2 10-20% * + 80%)

Gasna sterilizacija Uslovi procesa (parametri sterilizacije): T = 40-60°C (brzina reakcije se povećava 2.5 puta za svakih 10°C porasta T) koncetracija ETO 400-1299 mg/l vlažnost najmanje 33% vreme 1h – 30h * ETO dobro prodire u materijal ali se i zadržava (adsorbuje) u materijalu odakle se sporo otklanja (pod normalnim uslovima oko 14 dana, pod kontrolisanim uslovima 24h) – količina rezidualnog ETO 10 ppm (Ph Eur) u špricevima i sistemima za infuziju.

Sterilizacija zračenjem, Ph Jug V Primenjuje se za sterilizaciju termolabilnih materijala Dva tipa: Elektromagnetno (UV i gama zračenje) Čestično (elektroni visoke E) UV zračenje – uzak opseg talasnih dužina je efikasan u ubijanju MO (220 – 280 nm); Λ = 265 nm je najefikasnija – najbolje se apsorbuje od strane nukleoproteina Slaba moć penetracije, zbog toga što mnoge supstance/materijali jako apsorbuju Primenjuje se za sterilizaciju vazduha i vode u tankom sloju (površina), eventualno za čvrste, nepermeabilne površine Mehanizam inaktivacije MO UV zračenjem je stvaranje dimera timidina u DNK koji sprečava razmnožavanje MO

Ph. Eur. 8.0

Sterilizacija zračenjem – gama zračenje Visoko energetsko zračenje od 1-10-4 nm i E = 106 – 109 eV Izvor gama zraka su izotopi 60Co (kobalt 60) - koji emituje zračenje od 2 fotona 1.33 MeV i 1.17 MeV, a njegov poluživot je 5.25 godina i 137Cs (cezijum 137) - koji emituje zračenje sastavljeno od 1 fotona 1.61 MeV čiji je poluživot 30 godina Sterilizacija zračenjem izvodi se u komorama za radijaciju, gde se materijal koji se steriliše postavlja u statičnu poziciju blizu izvora zračenja Sterilizacija može biti diskontinuirana (za svaku seriju posebna) ili kontinuirana Pri sterilizaciji jonizujućim zračenjem važni su: doze odnosno raspoloživi nivo E (određuju stepen penetracije) raspoloživa proizvodna sila (određuje brzinu kojom će se doze primeniti)

Sterilizacija zračenjem – gama zračenje Doza zavisi od jačine izvora zračenja, od udaljenosti materijala od izvora, gustine (zbijenosti) materijala i vremena izlaganja koje može biti do 18h Doza je definisana kao E koju apsorbuje jedinica mase Jedinica = Grej (Gy); 1 Gy = 1 J/kg; 1KGy = 1 J/g Doza zračenja za sterilizaciju koja se obično preporučuje je 25 KGy (za veći deo Evrope) i 35 kGy (za Skandinaviju); za SAL = 10-6 Zavisno od "bioburden"-a usklađuje se doza, može se koristiti 2-8 KGy - udruženje za unapređenje medicinske instrumentacije (AAMI) u Americi dalo je uputstva za određivanje doze zračenja zavisno od rezistencije na radijaciju i "bioburden“

Sterilizacija zračenjem – gama zračenje Mehanizam delovanja – ekscitacija, jonizacija i tamo gde je prisutna voda stvaranje slobodnih radikala Slobodni radikali su moćni oksidišući (OH•, HO2 •) ili redukujući (H •) agensi koji su u stanju da oštete funkcionalne molekule u živim ćelijama (enzimi, DNK)  smrt ćelije Efikasnost zračenja se dodatno povećava u prisustvu kiseonika i vode, ali i degradacija, pa postoje ograničenja u slučaju vodenih rastvora Sterilizacija zračenjem se uspešno primenjuje za farmaceutske materijale: enzime, vitamine, peptide, minerale, antibiotike, monoklonska antitela Plazma, tkivo i koštani transplantati takođe mogu biti sterilisani gama radijacijom

Sterilizacija zračenjem – gama zračenje Najveća primena kod sterilizacije medicinskih instrumenata, plastičnih uređaja i delova uređaja, hirurških uniformi PREDNOSTI: mali porast T (oko 4°C)  fizičkohemijska stabilnost proizvoda i materijala IPAK – NEDOSTACI: hemijska degradacija (trenutna ili nakon skladištenja); promena boje, teksture i rastvorljivosti Promena potentnosti (zanemarljiva kod nekih antibiotika i steroidnih hormona), ali i značajan pad sadržaja kod insulina, heparina, cijanokobalamina, hormona hipofize...)...

Sterilizacija zračenjem – elektroni visoke E Ubrzane β čestice visokog energetskog nivoa uz upotrebu visoko voltažnih potencijala sterilišu predmete bombardovanjem Proizvodnja ubrzanih elektrona odvija se u akceleratorima (npr. van der Graaff akcelerator) Ubrzani elektroni mogu proizvesti x-zrake pa se okolina i osoblje moraju zaštititi Nedostatak upotrebe je mala moć penetracije u poređenju sa gama zracima Primena – alternativa gama zračenju u industriji