Απομόνωση και ταυτοποίηση Ρ. Τσιτσιλώνη, Π. Παπαζαφείρη Άσκηση 2 Απομόνωση και ταυτοποίηση Ανοσοσφαιρινών Α. Φωτεινοπούλου Ρ. Τσιτσιλώνη, Π. Παπαζαφείρη

Ανοσολογική απάντηση Ι. Ανοσογονικότητα: ικανότητα να επάγουν χυμική ή/και κυτταρική ανοσιακή απάντηση Εκτελεστικό Β-κύτταρο Β-κύτταρο μνήμης πλασματοκύτταρο Β-κύτταρο + αντιγόνο Εκτελεστικό Τ-κύτταρο Τ-κύτταρο μνήμης CTL, Th Τ-κύτταρο + αντιγόνο ΙΙ. Αντιγονικότητα: ικανότητα να συνδέονται με τα τελικά προϊόντα της ανοσιακής απάντησης

Δομή Ανοσοσφαιρινών Fab κ, λ γ, μ, α, δ, ε

Πρωτογενής και δευτερογενής απάντηση Χρόνος εμφάνισης Διάρκεια Τίτλος Τάξη Ιg Συγγένεια

Παραγωγή και καθαρισμός αντισωμάτων

Πρωτεϊνικά φορτία και pH

Ιοντοανταλλάκτες Ανιονικός ανταλλάκτης Κατιονικός ανταλλάκτης

Διαχωρισμός σε κολώνα DEAE-κυτταρίνης Δείγμα Διαχωρισμός πρωτεϊνών και συλλογή κλασμάτων ΄Εκλουση με: αύξηση ιονικής ισχύος μεταβολή pH Φωτομέτρηση κλασμάτων

Αυτοματοποιημένη συλλογή κλασμάτων Ρυθμιστικό διάλυμα Κολώνα ανταλλάκτη Φωτόμετρο & Καταγραφικό Συλλέκτης κλασμάτων

Δ1: Μαζική απομόνωση ανοσοσφαιρινών Σε κωνική βάζουμε: 5 ml DEAE κυτταρίνη Αφαιρούμε το φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα (~4-5 ml) Προσθέτουμε 200 μl ορό και αναδεύουμε ΗΠΙΑ Επώαση: 45 min, θερμοκρασία δωματίου / ανάδευση ανά 15 λεπτά / στο Τ Φυγοκέντρηση: 1000 στροφές, 5 λεπτά Συλλέγουμε το υπερκείμενο = ΥΠΕΡΚΕΙΜΕΝΟ Α (ανοσοσφαιρίνες) Στο ίζημα προσθέτουμε: 5 ml φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα/1 Μ KCl Επώαση: 15 min, θερμοκρασία δωματίου Συλλέγουμε το υπερκείμενο = ΥΠΕΡΚΕΙΜΕΝΟ Β (υπόλοιπες πρωτεΐνες) Φωτομέτρηση Α και Β: στα 280 nm στα 260 nm

Δ2: Χρωματογραφία σε στήλη Αφαιρούμε το υπερκείμενο ρυθμιστικό διάλυμα από το πάνω μέρος της στήλης Κλείνουμε τη στρόφιγγα ροής Επιστιβάζουμε ΠΡΟΣΕΚΤΙΚΑ 200 μl ορό Ανοίγουμε τη στρόφιγγα ροής Μόλις περάσει το δείγμα, προσθέτουμε 3 ml ρυθμιστικό διάλυμα Αρχίζουμε να συλλέγουμε κλάσματα (3 ml ανά σωληνάριο – μαύρη γραμμή) Προσθέτουμε άλλα 5 ml ρυθμιστικό διάλυμα Σταματάμε όταν συλλέξουμε 6 κλάσματα (Νο 1 – 6) Αφήνουμε να περάσουν άλλα 10 ml ρυθμιστικό (τα πετάμε στο δοχείο) Αφαιρούμε το επιπλέον ρυθμιστικό από το πάνω μέρος της στήλης Προσθέτουμε 5 ml φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα/1 Μ KCl Συνεχίζουμε να συλλέγουμε κλάσματα των 3 ml Σταματάμε όταν συλλέξουμε 6 κλάσματα (Νο 7 - 12) Ξεπλένουμε με τουλάχιστον 10 ml από το αρχικό ρυθμιστικό (στο δοχείο) Φωτομέτρηση όλων των κλασμάτων: στα 280 nm στα 260 nm

Πρότυπο διάλυμα αλβουμίνης (ml) Δ4: Ποσοτικός προσδιορισμός πρωτεϊνών Αριθμός σωληναρίου Πρότυπο διάλυμα αλβουμίνης (ml) Ορός (ml) Νερό 1 (τυφλό) - 1,0 2 0,1 0,9 3 0,2 0,8 4 0,5 5 6 7 (άγνωστο) 0,05 0,95 8 (άγνωστο) 0,10 σωλ. 1 Φυσιολογία Ζώων σωλ. 7 σωλ. 8 Προσθέτουμε 4 ml διουρίας (αντλία) – Αναδεύουμε Επώαση : 30 λεπτά, θερμοκρασία δωματίου Φωτομέτρηση ως προς το τυφλό στα 550 nm (πάγκος)

Αποτελέσματα – Υπολογισμοί (Ι) Δ1: συγκέντρωση πρωτεϊνών στα Α και Β (mg/ml) C (mg/ml) = 1.55 x OD280nm – 0.77 x OD260 nm για το τμήμα και την ομάδα σας Δ2: συγκέντρωση πρωτεϊνών στα 12 κλάσματα C (mg/ml) = 1.55 x OD280nm – 0.77 x OD260 nm για την ομάδα σας πίνακας (mg/κλάσμα) και γραφική παράσταση (mg/ml) Δ4: πρότυπη καμπύλη αλβουμίνης (Φυσιολογία Ζώων) συγκέντρωση ολικών πρωτεϊνών στα δείγματα του ορού για την ομάδα σας (mg/ml)

Αποτελέσματα – Υπολογισμοί (ΙΙ) Για το φυλλάδιό σας Μαζική απομόνωση : C πρωτεΐνης mg/ml και mg/κλάσμα για Α και Β για το τμήμα και την ομάδα σας 2. Χρωματογραφία σε στήλη : Πίνακας (mg/ml και mg/κλάσμα) και γραφική παράσταση (όπου άξονας χ: αριθμός κλάσματος, άξονας ψ: mg/ml ή mg/κλάσμα) Ποσοτικός προσδιορισμός (αναλυτικά) : ολικές πρωτεΐνες ορού (mg/ml) % ανάκτηση ανοσοσφαιρινών (IgG) και % ανάκτηση ολικών πρωτεϊνών για μαζική (τμήμα και ομάδα) και στήλη (ομάδα) 5. Ποια μέθοδος είναι πιο ευαίσθητη και γιατί?