ΑΝΑΛΥΣΗ ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΑΣΕΩΝ ΑΜΥΛΟΕΙΔΟΓΕΝΩΝ ΚΑΘΟΡΙΣΤΩΝ ΣΕ ΠΡΩΤΕΪΝΕΣ ΥΠΕΥΘΥΝΕΣ ΓΙΑ ΑΜΥΛΟΕΙΔΩΣΕΙΣ Φειδά Δ., Οικονομίδου Β.Α. και Χαμόδρακας Σ.Ι. Τομέας Βιολογίας Κυττάρου και Βιοφυσικής, Τμήμα Βιολογίας, Πανεπιστήμιο Αθηνών, Αθήνα 157 01 Τα αμυλοειδή ινίδια δημιουργούνται από διαλυμένες πρωτεΐνες ή πεπτίδια, που διπλώνονται κατά ανώμαλο τρόπο και αυτοσυγκροτούνται, δημιουργώντας αδιάλυτες εξωκυτταρικές (ή και ενδοκυτταρικές) εναποθέσεις γνωστές ως αμυλοειδή. Τα αμυλοειδή πιθανότατα προκαλούν καταστροφή κυττάρων και ιστών οδηγώντας σε μια σειρά ασθενειών γνωστές ως αμυλοειδώσεις. Η.Μ.Δ:Ευθύγραμμα, αδιακλάδιστα, απροσδιορίστου μήκους ινίδια. Αμυλοειδογενείς καθοριστές Πρόσφατες μελέτες υποδεικνύουν ότι συγκεκριμένα πεπτίδια της αλληλουχίας των πρωτεϊνών που είναι υπεύθυνες για αμυλοειδώσεις (αμυλοειδογενείς καθοριστές) ευθύνονται για το σχηματισμό τέτοιων ινιδίων, καθώς και ότι οι περισσότεροι αμυλοειδογενείς καθοριστές φαίνονται να είναι επιφανειακοί. Δέσμευση της χρωστικής Congo Red. -Ως αμυλοειδή ορίζονται εξωκυτταρικές, κυρίως, εναποθέσεις πρωτεϊνικών ινιδίων, που δημιουργούνται από διαλυμένες πρωτεϊνες ή πεπτίδια, όταν αυτά διπλώνονται κατά ανώμαλο τρόπο και αυτοσυγκροτούνται προκαλώντας μια σειρά ασθενειών γνωστές ως αμυλοειδώσεις. Τελευταία, έχουν συσχετιστεί και με μη παθολογικές καταστάσεις με την ονομασία λειτουργικά αμυλοειδή. Κριτίρια+ Χαρακτηριστική διπλοθλαστικότητα -Το κοινό δομικό γνώρισμα των αμυλοειδών ινιδίων είναι η ‘cross-β’ δομή, ενώ έχει δειχθεί ότι συγκεκριμένα πεπτίδια της αλληλουχίας των πρωτεϊνών που είναι υπεύθυνες για αμυλοειδώσεις ευθύνονται για το σχηματισμό τέτοιων ινιδίων (αμυλοειδογενείς-καθοριστές), τα περισσότερα εκ των οποίων φαίνεται να είναι επιφανειακά Περιθλασίγραμμα ακτίνων Χ: cross-β δομή

Αυτοσυγκρότηση ινιδίων Πολλά παραμένουν άγνωστα μέχρι και σήμερα. «Dry steric zippers» Sawaya et al. …. Eisenberg (2007) Nature, 447, 453-457 Aβ 35-40 ( MVGGVV), PDB code: 2ONA Στόχος μας Steric zipper Γιατί οι πλευρικές αλυσίδες παίρνουν τέτοια θέση στο χώρο που ομοιάζουν μορφολογικά με φερμουάρ. Dry (Στεγνό) Γιατί έχουν αποβληθεί τα μόρια του νερού (που θα μπορούσαν να αλληλεπιδρούν με πλευρικές αλυσίδες πολικών αμινοξέων). Η ανάλυση των αλληλεπιδράσεων αμυλοειδογενών καθοριστών σε πρωτεΐνες υπεύθυνες για αμυλοειδώσεις, καθώς και η πιθανή εύρεση προτύπων αλληλεπιδράσεων των αμινοξικών καταλοίπων των αμυλοειδογενών καθοριστών με την υπόλοιπη πρωτεΐνη. Αβ Found in Alzheimer disease brain lesions Ομοιάζουν μορφολογικά ή μήπως και λειτουργικά? -, σύμφωνα με το μοντέλο της ‘μερικής αποδιάταξης’, το οποίο προτάθηκε πρόσφατα, μία φυσιολογική πρωτεΐνη αποδιατάσσεται μερικώς, ώστε να αποκαλυφθεί ο ‘αμυλοειδογενής- καθοριστής’, ο οποίος αλληλεπιδρά με έναν άλλο, ενός άλλου μερικώς αποδιαταγμένου μορίου της πρωτεΐνης σχηματίζοντας έτσι τον ‘cross-β’ σκελετό του υπό ανάπτυξη ινιδίου -Κρυσταλλογραφικές μελέτες έχουν δείξει ότι, ορισμένα από τα αμυλοειδογενή αυτά πεπτίδια, σχηματίζουν «dry steric zippers» με αλληλεπιδράσεις των πλευρικών τους αλυσίδων, στα σχηματισμένα αμυλοειδή ινίδια, εξασφαλίζοντας έτσι, πολύ ‘καλό’ πακετάρισμα μεταξύ τους και ιδιαίτερη σταθερότητα. -Τι συμβαίνει όμως με αυτούς τους ‘αμυλοειδογενείς-καθοριστές’ στην «φυσιολογική» (μη αποδιαταγμένη) πρωτεΐνη; Σκοπός της εργασίας ήταν η μελέτη, με τη βοήθεια προγραμμάτων μοριακών γραφικών, των αλληλεπιδράσεων των πειραματικά προσδιορισμένων ‘αμυλοειδογενών-καθοριστών’ στις αντίστοιχες πρωτεΐνες που ευθύνονται για αμυλοειδώσεις και η πιθανή εύρεση προτύπων αλληλεπίδρασης μεταξύ καταλοίπων.

Μεθοδολογία Αποτελέσματα Δουλεύουμε με ένα σύνολο 7 πρωτεϊνών, των οποίων οι δομές έχουν «λυθεί» κρυσταλλογραφικά (PDB) και έχουν προσδιορισμένους πειραματικά αμυλοειδογενείς καθοριστές. Οι πρωτεΐνες αυτές σχετίζονται με γνωστές αμυλοειδώσεις του ανθρώπου. Μελετήσαμε τους αμυλοειδογενείς καθοριστές και το «περιβάλλον» τους μέσα στην πρωτεΐνη, με τη βοήθεια προγραμμάτων μοριακών γραφικών (PyMOL). aa #aa Αλληλεπιδράσεις με... G 4 L(2), N (1), C (1) A 7 L (1) V 15 V (3), I (3), L (2), R (1), Q (1), A (1), F (1), Y (1), E (1), D (1) L 14 L (6), V (3), I (2), E (1) I 5 S (2), F (1), V (1), L (1), T (1), Q (1), A (1) M 1 - P S 6 T Y (1), L (1) C V (2), L (1), R (1), A (1), C (1) F 8 I (2), F (2), S (1), K (1), R (1), V (1), L (1) Y L (3), T (1), F (1), V (1), E (1) W 3 F (1), W (1) D N (1), R (1) E 2 N C (1) Q H D (1), S (1) K R Parent proteins PDB code Experimental regions Amylpred Consensus Transthyretin 1BMZ 10-19 11-17 105-115 105-111 Lactoferrin 1CB6 538-545 542-551 542-545 beta2- Microglobulin 1LDS 20-41 21-29 59-71 60-69 72-99 79-83 Lysozyme C 1LZ1 49-64 55-59, 61-65 Gelsolin 2FGH 183-210 186-192 Prolactin 1RW5 7-21, 20-34 11-16, 21-33 11-16, 18-31 43-57 Apolipoprotein Α-Ι 2AO1 1-93 14-22 53-58 69-72 Transthyretin A mutant form of a normal serum protein that is deposited in the genetically determined familial amyloid polyneuropathies. TTR is also deposited in the heart in senile systemic amyloidosis. Beta2-microglobulin Not to be confused with Aβ, β2m is a normal serum protein, part of major histocompatibility complex (MHC) Class 1 molecules. Can occur in long term haemodialysis. Χρησιμοποιήσαμε επιλεκτικά και το πρόγραμμα AmylPred, το οποίο είναι μία συναινετική μέθοδος πρόγνωσης της «αμυλοειδογενούς προδιάθεσης», η οποία αναπτύχθηκε πρόσφατα στο εργαστήριό μας. (http://biophysics.biol.uoa.gr/AMYLPRED/ Frousios et al., submitted).

Magenta: Πειραματικά προσδιορισμένοι αμυλοειδογενείς καθοριστές Μαύρες στικτές γραμμές: δείχνουν αποστάσεις μεταξύ αμινοξικών καταλοίπων που απέχουν από 3.0-4.5 Å Αποτελέσματα Transthyretin (1BMZ) Apolipoprotein Α-Ι (2A01) . Τα μέχρι τώρα αποτελέσματα δείχνουν ότι οι ‘αμυλοειδογενείς-καθοριστές’ βρίσκονται πολύ καλά πακεταρισμένοι μέσα στην πρωτεΐνη, γεγονός το οποίο στηρίζει το μοντέλο της ‘μερικής αποδιάταξης’, εφόσον θα ήταν δύσκολη η αλληλεπίδραση τους με πεπτίδια άλλου μορίου πρωτεΐνης χωρίς να συμβαίνει μερική τουλάχιστον αποδιάταξη.

Συμπεράσματα- Συζήτηση Τα αποτελέσματα, όπως περιμέναμε, δείχνουν ότι τα αμυλοειδογενή πεπτίδια είναι πολύ καλά πακεταρισμένα στην φυσιολογική πρωτεΐνη Επιβεβαιώνεται έτσι η ανάγκη για μερική τουλάχιστον αποδιάταξη της πρωτεΐνης προκειμένου να αποκαλυφθούν τα πεπτίδια αυτά και να ξεκινήσει ο σχηματισμός αμυλοειδών ινιδίων Με μία πρώτη ανάλυση που κάναμε είδαμε πως δεν παρουσιάζεται κάποιο προφανές πρότυπο κατανομής των αμινοξικών καταλοίπων στους αμυλοειδογενείς καθοριστές Περαιτέρω συστηματική μελέτη θα εστιαστεί σε πιθανή εύρεση προτύπων αλληλεπιδράσεων μεταξύ των αμινοξικών καταλοίπων των αμυλοειδογενών καθοριστών και της υπόλοιπης πρωτεΐνης.