«ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΠΑΘΟΓΟΝΩΝ ΜΕΤΑΛΛΑΞΕΩΝ ΤΟΥ ΚΑΡΒΟΞΥΤΕΛΙΚΟΥ ΑΚΡΟΥ (BRCT) ΤΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ BRCA1 ΣΤΗΝ ΔΟΜΙΚΗ ΣΤΑΘΕΡΟΤΗΤΑ, ΣΤΗΝ ΕΝΔΟΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΤΟΠΟΛΟΓΙΑ ΚΑΙ ΣΤΗΝ ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΟΥ ΜΟΡΙΟΥ ΜΕ ΑΛΛΕΣ ΠΡΩΤΕΪΝΕΣ» Ι. Δρίκος, E. Mπούτου, Κ. Ε. Βοργιάς Τομέας Βιοχημείας και Μοριακής Βιολογίας, Τμήμα Βιολογίας, Εθνικό Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών, Πανεπιστημιούπολη-Ζωγράφου, 15701 Αθήνα, Ελλάδα cvorgias@biol.uoa.gr. H ογκοκατασταλτική πρωτεΐνη BRCA1 συμμετέχει στις διαδικασίες επιδιόρθωσης του γενετικού υλικού καθώς και στον έλεγχο του κυτταρικού κύκλου, αλληλεπιδρώντας με μεγάλο αριθμό πρωτεϊνών όπως οι BACH1, CtIP, p53 και Rad51. Μεταλλάξεις του καρβοξυτελικού άκρου της BRCA1, οι οποίες εντοπίζονται σε ασθενείς, επηρεάζουν την ικανότητα αλληλεπίδρασης της BRCA1 με τις πρωτεΐνες BACH1 και CtIP. Στόχος της παρούσας εργασίας είναι ο προσδιορισμός της επίδρασης σημειακών μεταλλάξεων στη δομή και την λειτουργία του BRCA1-BRCT. Για το λόγο αυτό, το καρβοξυτελικό άκρο φυσικού τύπου όσο και τα μεταλλαγμένα, κλωνοποιήθηκαν και εκφράστηκαν σε προκαρυωτικούς φορείς έκφρασης. Οι ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες παράχθηκαν σε σταθερή και καθαρή μορφή. Στην προσπάθεια μας να προσδιορίσουμε την επίδραση των συγκεκριμένων παθογόνων μεταλλάξεων του καρβοξυτελικού άκρου στην ενδοκυτταρική τοπολογία της BRCA1, δημιουργήθηκαν συζευγμένα μεταλλάγματα του της πρωτεΐνης BRCA1 στο καρβοξυτελικό άκρο με GFP, τα οποία εισήχθηκαν σε κύτταρα MCF7

Υλικά και μέθοδοι Tο καρβοξυτελικό άκρο φυσικού τύπου όσο και τα μεταλλαγμένα, κλωνοποιήθηκαν και εκφράστηκαν σε προκαρυωτικούς φορείς έκφρασης. Οι ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες παράχθηκαν σε σταθερή και καθαρή μορφή. Βιοφυσική ανάλυση της δευτεροταγούς δομής και η θερμική σταθερότητα των τμημάτων BRCT, τόσο φυσικού τύπου όσο και των μεταλλαγμένων, πραγματοποιήθηκε με χρήση φασματογράφου κυκλικού διχρωϊσμού (CD) και μικροθερμιδομετρία διαφορικής σάρωσης (DSC). Η ικανότητα αλληλεπίδρασης των BRCA1-BRCTs με συνθετικά φωσφοπεπτίδια,, μελετήθηκε με μικροθερμιδομετρία μοριακής τιτλοδότησης (ITC). Τα αποτελέσματα βιοφυσικής ανάλυσης των μεταλλαγμένων καρβοξυτελικών τμημάτων BRCA1-BRCT (V1696L, M1652I, M1775K, M1783T, V1809F, P1812A) φανερώνουν την αλλαγή στην σταθερότητα του μορίου και την ικανότητα αλληλεπίδρασης με τα συνθετικά φωσφοπεπτίδια (pBACH1, pCtIP). Με κατευθυνόμενη μεταλλαξιγένεση σχηματίστηκαν μεταλλάγματα της BRCA1, στο καρβοξυτελικό άκρο, συζευγμένα με GFP Η ανάλυση της ενδοκυτταρικής τοπολογίας των GFP-BRCA1-BRCT’s καθώς και των p53 και Rad51, πραγματοποιήθηκε με μικροσκοπία ανάστροφου φθορισμού και την χρήση μονοκλωνικών αντισωμάτων για τις πρωτεΐνες p53, RAD51.

Κυκλικός διχροϊσμός (CD) Βιοφυσική Ανάλυση Κυκλικός διχροϊσμός (CD) Καθαρισμός με χρήση χρωματογραφίας ιονανταλλαγής Ανάλυση δευτεροταγούς δομής των καρβοξυτελικών άκρων wt-BRCT (○), M1775K (●), V1696L (+), P1812A (X), M1783T (--), M1652I ( ), V1809F ( ) σε 25 °C. Μικροθερμιδομετρία διαφορικής σάρωσης (DSC) Συγκριτική ηλεκτροφόρηση κλασμάτωv του καρβοξυτελικού άκρου της BRCA1 της κανονικής πρωτεΐνης και των μεταλλαγμένων μορφών, wt-BRCT, P1812A, V1809F, M1783T, M1775K, M1652I και V1696L Χρωματογραφία Μοριακής Διήθησης (Gel Filtration) Θερμική απόδιαταξη των καρβοξυτελικών άκρων V1809F, M1783T, M1775K, P1812A, V1696L and M1652I, wt-BRCT σε pH 9.0, 5mM Βορικού-Νa, 200 mM NaCl Μικροθερμιδομετρία ισόθερμης τιτλοδότησης (ITC) Χρωματογραφία μοριακής διήθησης σε στήλη (Superose TM12). Η κορυφή έκλουσης των BRCT τμημάτων σε pH 9.0 (5mΜ Βορικού-Na, 200mM NaCl) αντιστοιχεί σε μοριακό βάρος της μονομερούς μορφής (24.5 kDa).

Κυτταρικός εντοπισμός των φυσικών και μεταλλαγμένων πρωτεϊνών wtBRCA1, M1652I-BRCA1, V1809F-BRCA1, M1775K-BRCA1 Ενδοκυτταρικός συνεντοπισμός των πρωτεϊνών GFP-BRCA1, RAD51,p53 σε κυτταρική σειρά MCF-7 πριν και μετά την έκθεση σε υπεριώδη ακτινοβολιά

Συμπεράσματα Το καρβοξυτελικό άκρο της BRCA1 απομονώνεται σε υψηλή συγκέντρωση, σταθερή και μονομερή κατάσταση, όπως προκύπτει από τα αποτελέσματα χρωματογραφίας μοριακής διήθησης. Οι εξετασθείσες μεταλλάξεις επηρεάζουν την θερμική σταθερότητα του μορίου όπως προκύπτει από τα αποτελέσματα θερμικής αποδιάταξης. Τα μεταλλαγμένα καρβοξυτελικά άκρα εμφανίζουν αξιοσημείωτα διαφοροποιημένη ικανότητα αλληλεπίδρασης με συνθετικά φωσφοπεπτίδια τμήματα των πρωτεϊνών CtIP και BACH1. Οι εξετασθείσες μεταλλάξεις δεν επηρεάζουν την δευτροταγή δομή του μορίου όπως προκύπτει από τα εξαχθέντα φάσματα κυκλικού διχρωϊσμού. Οι κλινικά σχετιζόμενες μεταλλάξεις του καρβοξυτελικού φαίνεται να επηρεάζουν την ενδοκυτταρική τοπολογία της BRCA1, φανερώνοντας την γενικευμένη αλλαγή της λειτουργία της πρωτεΐνης, η οποία προκαλείται από τις μεταλλάξεις του καρβοξυτελικού άκρου. Από τα αποτελέσματα των δομικών αναλύσεων θα μπορούσαμε να προτείνουμε ότι η θέση των επιλεγμένων μεταλλάξεων και οι ιδιότητες των πλευρικών τους αλυσίδων να συμμετέχουν σε ενδομοριακές και διαμορικές αλληλεπιδράσεις υποδηλώνουν την συμμετοχή των συγκεκριμένων αμινοξέων στην αποσταθεροποίηση της δομής του καρβοξυτελικού άκρου και στην διαταραχή των μοριακών συνδέσεων. Επίσης η δομική επίδραση των μεταλλάξεων αυτών συνδέεται άμεσα με την διαφοροποίηση της ενδοκυτταρικής τοπολογία της πρωτεΐνης BRCA1.