Άμεσες μέθοδοι μετασχηματισμού φυτών Άμεσες μέθοδοι μετασχηματισμού φυτών

Ingo Potrykus

Πληθυσμοί φυτικών κυττάρων

Παροδική Έκφραση Σταθερή Έκφραση Υψηλή έκφραση του φορέα για βραχύ χρονικό διάστημα (12-72 hrs) Υψηλή έκφρασή τους μπορεί να οδηγήσει σε αναστολή της ανάπτυξης των κυττάρων ή σε αναδιάταξη του φορέα. Χρησιμοποιούνται σε μεταβολικές μελέτες με γονίδια αναφοράς. Εξασφαλίζεται με φορείς οι οποίοι επιτρέπουν την επιλογή ή διαθέτουν γονίδιο απαραίτητο για την επιβίωση. Ενσωματώνονται στο γονιδίωμα – κληρονομούνται στις επόμενες γενιές Υπάρχουν σαν επισώματα (π.χ. Ιοί)

Παροδικός / Σταθερός Μετασχηματισμός Παροδικός / Σταθερός Μετασχηματισμός Παροδικός Μετασχηματισμός DNA εκτός χρωμοσώματος Ορατό αποτέλεσμα μερικές μέρες μετά τον μετασχηματισμό Σταθερός μετασχηματισμός Το DNA ενσωματώνεται στο χρωμόσωμα Αποδεικνύεται με την κληρονόμηση του διαγονιδίου Διασχίζεται στους απογόνους

Ανάλυση Παροδικής Εκφρασης Ιστοειδικότητα Πόσοι ιστοί; Περιορίζεται σε ιστούς που μπορούν να μετασχηματισθούν Ισως απαιτηθεί ενσωμάτωση στο χρωμόσωμα Οι περισσότεροι υποκινητές είναι κατάλληλοι Ποσοτικοποίηση Εκτίμηση δραστικότητας υποκινητή Ελεγχος σημασίας ιντρονίων, εξωνίων, 5  και 3 UTRs κ.α. Δεν είναι όλα τα γονίδια αναφοράς κατάλληλα

Τυχαίες ενθέσεις γονιδίων Φυτικά χρωμοσώματα T-DNAs Συχνά περισσότερες από μία ενθέσεις Η δράση τους καθορίζεται και από τη θέση τους

Bομβαρδισμός σωματιδίων (particle bombardment) Καπνός Σόγια Καλαμπόκι Σιτάρι

Bομβαρδισμός σωματιδίων (particle bombardment)

Bομβαρδισμός σωματιδίων (particle bombardment) ΔΕΙΓΜΑΤΑ Δισκία φύλλου Ανώριμα έμβρυα Εμβρυογόννα κύτταρα κάλου

Βομβαρδισμός (Particle Bombardement- Biolistics) Ένα «όπλο»

Ηλεκτροδιάτρηση (electroporation) ~400 V / cm για 10-15 milliseconds 1000-1500 V /cm ~10 microseconds

Ηλεκτροδιάτρηση (electroporation) ΡΥΖΙ ΚΑΛΑΜΠΟΚΙ ΣΙΤΑΡΙ ΚΑΠΝΟΣ ΠΛΑΣΜΑΛΛΥΜΑ ΜΕΓΑΛΑ ΤΜΗΜΑΤΑ ΕΥΘΥΓΡΑΜΜΟΥ DNA

Πολαιθυλενική γλυκόλη (polyethyleneglycol -PEG) Αλλάζει τις ιδιότητες της κυτταρικής μεμβράνης Χρησιμοποιείται σε: Πρωτοπλάστες Γυρεόκοκκους Ώριμα έμβρυα Σπόρους

Μικροέκχυση (microinjection) Η πίεση στο εσωτερικό φυτικών κυττάρων είναι μεγαλύτερη από ότι αυτή σε κύτταρα ζώων. Όταν ένα φυτικό κύτταρο τρυπηθεί συνήθως πεθαίνει μετά το τρύπημα.

Μετασχηματισμός με Λιποσώματα

Μετασχηματισμός με Λιποσώματα

Μετασχηματισμός με Λιποσώματα Νουκλεϊνικά οξέα εγκολπώνονται σε συνθετικές φυσαλίδες των λιπιδίων των μεμβρανών και ενσωματώνονται στο στρώμα των λιπιδίων. Πλεονεκτήματα: Σχετικά υψηλή αποτελεσματικότητα Κατάλληλοι για διάφορους τύπους κυττάρων Για μεταφορά DNA, RNA, πρωτεϊνών Μειονεκτήματα: Ακριβή μέθοδος και σε κάποιες περιπτώσεις κυτοτοξική Απαιτεί κανονικοποίηση

Λιπόσωμα

Μετασχηματισμός με κατακρύμνιση CaPO4

Μετασχηματισμός με κατακρύμνιση CaPO4 Ένωση που προκαλεί την κατακρήμνιση του DNA επιτρέποντας στα κύτταρα να προσλάβουν DNA είτε με ενδοκύτωση είτε με φαγοκύτωση Παράγοντες που επηρεάζουν την αποτελεσματικότητα της πρόσληψης DNA: pH Ποιότητα του DNA Στάδιο ανάπτυξης κυττάρων

Μετασχηματισμός με κατακρύμνιση CaPO4 Φθηνά αναλώσιμα Απαιτεί προσεκτική παρασκευή των αντιδραστηρίων —Τα διαλύμματα του CaPO4 είναι ευαίσθητα στο pH Κυτοτοξικά Προβλήματα στην επαναληψιμότητα

Μετασχηματισμός με ίνες σιλικόνης καρβιδίου Μετασχηματισμός με ίνες σιλικόνης καρβιδίου