ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΜΟΣ ΚΑΙ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΤΟΥΣ ΚΑΡΚΙΝΙΚΑ ΑΝΤΙΓΟΝΑ: ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΜΟΣ ΚΑΙ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΤΟΥΣ Ράνια Τσιτσιλώνη

Κύριοι σταθμοί στην Ανοσολογία του Καρκίνου 1908: positive mechanism eliminating transformed cells 1965: # immunological memory for cancer cells (mice) # immune surveillance-recognition and destruction of non-self tumor cells on their appearance 1970: lymphocytes can kill autologous melanoma cells 1991: cloning of the first tumor antigen (Belgium) 2003: therapeutic & prophylactic vaccines in the market

Θεραπεία καρκινοπαθών με ζωντανά βακτήρια BCG ? Coley, 1893

Κύριοι σταθμοί στην Ανοσολογία του Καρκίνου 1908: positive mechanism eliminating transformed cells 1965: # immunological memory for cancer cells (mice) # immune surveillance-recognition and destruction of non-self tumor cells on their appearance 1970: lymphocytes can kill autologous melanoma cells 1991: cloning of the first tumor antigen (Belgium) 2003: therapeutic & prophylactic vaccines in the market

Ανοσολογική μνήμη για τα καρκινικά κύτταρα IMMUNIZE CHALLENGE OUTCOME KILLED TUMOR CELLS VIABLE TUMOR CELLS control no growth growth Mitchison, 1967

Κύριοι σταθμοί στην Ανοσολογία του Καρκίνου 1908: positive mechanism eliminating transformed cells 1965: # immunological memory for cancer cells (mice) # immune surveillance-recognition and destruction of non-self tumor cells on their appearance 1970: lymphocytes can kill autologous melanoma cells 1991: cloning of the first tumor antigen (Belgium) 2003: therapeutic & prophylactic vaccines in the market

Τα λεμφοκύτταρα «εκπαιδεύονται» για να λύουν καρκινικά κύτταρα tumor cells from melanoma patient lymphocytes from the same melanoma patient MLTC for one week recovered lymphocytes can kill melanoma cells recovered lymphocytes can proliferate Parmiani et al, 1971

Κύριοι σταθμοί στην Ανοσολογία του Καρκίνου 1908: positive mechanism eliminating transformed cells 1965: # immunological memory for cancer cells (mice) # immune surveillance-recognition and destruction of non-self tumor cells on their appearance 1970: lymphocytes can kill autologous melanoma cells 1991: cloning of the first tumor antigen (Belgium) 2003: therapeutic & prophylactic vaccines in the market

Κλωνοποίηση του πρώτου καρκινικού αντιγόνου 1. CTL generation 3. Transduce eukaryotic cells or bacteria with tumor cDNA libraries Τu 3 CTL 3 CTL 1 Τu 1 4. Test for lysis by CTL CTL 2 Τu 2 5. Clone Ag by direct packaging in λ-phages 2. Screening + Lysis CTL sensitive CTL 1 + 1st human tumor antigen = MAGE-1 (melanoma) Lysis CTL sensitive CTL 2 + Lysis CTL sensitive CTL 3 + No lysis CTL resistant CTL 4 Van den Eynde et al, 1991

Κύριοι σταθμοί στην Ανοσολογία του Καρκίνου 1908: positive mechanism eliminating transformed cells 1965: # immunological memory for cancer cells (mice) # immune surveillance-recognition and destruction of non-self tumor cells on their appearance 1970: lymphocytes can kill autologous melanoma cells 1991: cloning of the first tumor antigen (Belgium) 2003: therapeutic & prophylactic vaccines in the market

Εμπορικά διαθέσιμα αντικαρκινικά εμβόλια Melacine (human melanoma) 10-20 % OR Canvacine (human melanoma) ? mAbs (Herceptin, rituximab, mylotarg, etc) Therapeutic Gardasil (h. cervical cancer) HBV vaccine (liver cancer) ? mucin I (colon cancer) ? breast cancer? pancreatic cancer? Prophylactic Finn OJ, 2003

Tα Τ κύτταρα «βλέπουν» το εσωτερικό του καρκινικού κυττάρου Berzofsky et al, 2004

Η φύση των καρκινικών αντιγόνων Tumor specific antigens (TSA), present only on tumor cells encoded by genes specifically expressed by tumors (MAGE) encoded by variant forms of normal genes altered by mutations (β-catenin) b. Tumor associated antigens (TAA), present on tumor cells and some normal cells normally expressed at certain differentiation stages or lineages (tyrosinase, Melan-A/MART-1) mutated proteins (k-ras, p53) overexpressed proteins (HER-2/neu)

Μηχανισμοί δημιουργίας καρκινικών αντιγόνων (or specific gene expression) (or expression of mutated protein)

Μέθοδοι ταυτοποίησης Γενετική προσέγγιση Βιοχημική προσέγγιση Αντίστροφη ανοσολογία (reverse immunology) Ορολογική προσέγγιση (SEREX) Χρησιμοποίηση διαγονιδιακών ποντικών

Γενετική προσέγγιση (Ι) Δημιουργία CTL σειρών έναντι αυτόλογων καρκινικών κυττάρων Οι CTL σειρές εμπεριέχουν πολλούς CTL κλώνους που αναγνωρίζουν ΤΑΑ πάνω στους κλώνους των καρκινικών κυττάρων Τu 1 CTL 1 CTL 3 Τu 3 CTL 2 Τu 2

Γενετική προσέγγιση (ΙΙ) Κλωνοποίηση καρκινικών και έλεγχος λύσης τους από τις αυτόλογες CTL σειρές. Οι καρκινικοί κλώνοι που είναι αρνητικοί για το ΤΑΑ δεν αναγνωρίζονται και επιβιώνουν. + Λύση CTL ευαίσθητος CTL 1 + Λύση CTL ευαίσθητος CTL 2 + Λύση CTL ευαίσθητος CTL 3 + Όχι λύση CTL ανθεκτικός CTL 4

Γενετική προσέγγιση (ΙΙΙ) Δημιουργία γενομικών ή cDNA βιβλιοθηκών από τους CTL ευαίσθητους καρκινικούς κλώνους Διαμόλυνση CTL ανθεκτικών καρκινικών κυττάρων (αυτόλογων ή που να εκφράζουν το κατάλληλο ΜΗC αλληλόμορφο) με το cDNA Χαρακτηρισμός των διαμολυνθέντων κυττάρων που εκφράζουν το ΤΑΑ βασιζόμενοι στην ικανότητα τους να λύονται από το ανάλογο ογκοειδικό CTL Απομόνωση του γονιδίου που κωδικοποιεί για το ΤΑΑ με άμεσο πακετάρισμα σε λ-φάγους

Βιοχημική προσέγγιση (Ι) Δημιουργία CTL σειρών έναντι αυτόλογων καρκινικών κυττάρων MHC molecule Τumor cell CTL Antigenic peptide Εκχύλιση των πεπτιδίων που βρίσκονται στις σχισμοειδείς θήκες των MHC μορίων.

Βιοχημική προσέγγιση (ΙΙ) Διαχωρισμός των πεπτιδίων με HPLC και συλλογή των επιμέρους κλασμάτων. Φόρτωμα του κάθε πεπτιδικού κλάσματος σε κύτταρα-στόχους που φέρουν πανομοιότυπα MHC αλληλόμορφα (πχ Τ2) και έλεγχος λύσης τους από τα ογκοειδικά CTL. CTL CTL CTL CTL

Βιοχημική προσέγγιση (ΙΙΙ) Ταυτοποίηση του πεπτιδίου με δεύτερο διαχωρισμό σε αναλυτικότερο HPLC, αποικοδόμηση κατά Edman και φασματοσκοπία μάζας (tandem mass spectrometry). TAA peptide 1 TAA peptide 3 TAA peptide 2 TAA peptide 4

Αντίστροφη ανοσολογία (Ι) Σύνθεση πεπτιδίων από την αλληλουχία μιας ογκοειδικής πρωτεΐνης (πχ. HER2/neu) βασιζόμενοι στην παρουσία συγκεκριμένων αμινοξικών καταλοίπων (anchor motifs) για ένα ορισμένο αλληλόμορφο (πχ HLA-A2). Βάσεις για πρόβλεψη πεπτιδίων μέσω αλγορίθμων: http://bimas.dcrt.nih.gov:80/molbio/hla_bind http://www.uni-tuebingen.de/uni/kxi/SYFPEITHI

anchors or auxiliary anchors HLA-A2 HLA-DR4 1 2 1 3 2 4 8 9 7 3 4 9 5 6 5 6 7 8 Position 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Position 1 2 3 4 5 6 7 8 9 anchors or auxiliary anchors L V V M L preferred residues E K other residues I A G I I A E L Y P K L Y S F F D Y T H K P T N M M G Y S F V R V H anchors or auxiliary anchors F W I L V M P W I L V A D E N S T Q H R D E H K N Q R S T Y A C I L M V D E H K N Q R S T Y A C I L M V

Αντίστροφη ανοσολογία (ΙΙ) Έλεγχος συγγένειας πρόσδεσης σε MHC (συγκέντρωση πεπτιδίου που αναστέλλει το 50 % της πρόσδεσης γνωστού πεπτιδίου MHC-προσδέτη) + + 100 % πρόσδεση ΜΗC β2-μικροσφ MHC-προσδέτης + + + + 50 % πρόσδεση νέο πεπτίδιο Ικανότητα πεπτιδίου να επάγει CTL (δημιουργία CTL ικανών να λύουν κύτταρα-στόχους [Τ2] φορτωμένα με το πεπτίδιο) + Λύση T2 CTL

Αντίστροφη ανοσολογία (ΙΙΙ) Έκφραση του πεπτιδίου και σε καρκινικά κύτταρα τα οποία να λύονται από τα CTL εφόσον εκφράζουν την πατρική ογκοπρωτεΐνη (ο επίτοπος να είναι και naturally processed) + Λύση T2 CTL + Λύση Tu CTL επεξεργασία του αντιγόνου Tu

Ορολογική προσέγγιση (Ι) SEREX: serological analysis of the autologous tumor antigens by recombinant cDNA expression Δημιουργία cDNA βιβλιοθήκης από φρέσκα καρκινικά δείγματα (πχ. χειρουργικά αφαιρεθέντες όγκοι ή καρκινικά κύτταρα από ασκιτικά και πλευριτικά υγρά) Η βιβλιοθήκη κλωνοποιείται σε λ-φάγο Οι ανασυνδυασμένοι φάγοι μεταφέρουν το DNA σε βακτήρια E. coli (λυτική μόλυνση) Μεταφορά ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης Ανίχνευση αντιδραστικότητάς τους με IgG αντισώματα που υπάρχουν στον ορό του ασθενούς (χρήση αραιωμένου ορού του ασθενούς) Προσδιορισμός της αλληλουχίας νουκλεοτιδίων από το εισαχθέν cDNA.

Ορολογική προσέγγιση (II)

Ορολογική προσέγγιση (IIΙa) Πλεονεκτήματα της μεθόδου SEREX Χρησιμοποίηση κυττάρων από τον όγκο: δεν χρειάζεται καλλιέργεια καρκινικών κυττάρων in vitro, μείωση artifacts λόγω μακρόχρονης καλλιέργειας (πχ. έκφραση νέων αντιγόνων από τα καρκινικά) Εντοπισμός αντιγόνων που προκαλούν ισχυρή ανοσοαπόκριση στον καρκινοπαθή (ο ορός του ασθενή αραιώνεται 1:100-1:1000 και άρα οδηγεί στον εντοπισμό IgG ανοσοσφαιρινών που βρίσκονται σε υψηλό τίτλο στον ορό, άρα επάγεται υψηλού βαθμού ενεργοποίηση των Τh κυττάρων) Με τη χρησιμοποίηση cDNA βιβλιοθηκών η ανάλυση δεν περιορίζεται σε επιφανειακά αντιγόνα, αλλά καλύπτει το σύνολο των πρωτεϊνών που εκφράζονται από τα γονίδια του όγκου Επιτρέπει τον απευθείας μοριακό προσδιορισμό των αντιγόνων αφού η αλληλουχία του cDNA των αντιγόνων του όγκου μπορεί να προσδιοριστεί άμεσα Η έκφραση του αντιγόνου σε φυσιολογικό ιστό μπορεί να προσδιοριστεί με ανάλυση της έκφρασης του mRNA με Nothern Blot και Reverse Transcription-PCR, χωρίς να χρειάζεται η καλλιέργεια κυττάρων που μπορεί να οδηγήσει σε artifacts

Ορολογική προσέγγιση (IΙIb) Προβλήματα της μεθόδου SEREX Ψευδώς θετικά αποτελέσματα: προέρχονται από την έκφραση γονιδίων ανοσοσφαιρινών στα βακτήρια λόγω της ύπαρξης λεμφοκυττάρων ανάμεσα στα κύτταρα του όγκου κατά την κατασκευή της cDNA βιβλιοθήκης. Δεν μπορεί να ανιχνευτεί όλο το φάσμα των καρκινικών αντιγόνων (πχ. γλυκοσυλιωμένα αντιγόνα ή αντιγόνα που υπόκεινται σε μετατροπές κατά την έκφρασή τους σε βακτήρια) Χάνονται αντιγόνα που δεν έχουν προλάβει να προκαλέσουν ανοσολογική απόκριση από τον οργανισμό κατά τη στιγμή της χειρουργικής αφαίρεσης του όγκου

Χρήση διαγονιδιακών ζώων (Ι) Σύνθεση πεπτιδίων με επικαλυπτόμενες αλληλουχίες από μια ανθρώπινη ογκοειδική ή ογκοσχετιζόμενη πρωτεΐνη 1 40 πατρική πρωτεΐνη 1-10 5-15 10-20 15-25 20-30 25-35 30-40

Χρήση διαγονιδιακών ζώων (ΙΙ) Ανοσοποίηση διαγονιδιακών ποντικών που εκφράζουν συγκεκριμένο HLA αλληλόμορφο με την ανασυνδυασμένη πατρική ογκοπρωτεΐνη HLA-A2 HLA-B27 ογκοπρωτεΐνη ογκοπρωτεΐνη Τ λεμφοκύτταρα που αναγνωρίζουν HLA-A2-περιοριζόμενα πεπτίδια από την ογκοπρωτεΐνη Τ λεμφοκύτταρα που αναγνωρίζουν HLA-B27-περιοριζόμενα πεπτίδια από την ογκοπρωτεΐνη

Χρήση διαγονιδιακών ζώων (ΙΙΙ) Δοκιμασία παραγωγής IFN-γ από Τ λεμφοκυττάρων των ποντικών όταν ενεργοποιηθούν με τα συνθετικά πεπτίδια (ELISA ή ELISPOT) ELISA ELISPOT +/ve -/ve -/ve +/ve +/ve

Reactivity in vitro (%) to Clinical objective responses (%) Τροποποιήσεις συνθετικών πεπτιδίων (κλινική δοκιμή με επίτοπο της gp100 σε ασθενείς με μελάνωμα) gp100209-217 : 1 2 3 4 5 6 7 8 9 I T D Q V P F S V wild type I M D Q V P F S V modified gp100209-217(M) vs. gp100209-217(wt) : in vitro studies: 9-fold better binding to HLA-A*201 higher levels of IFN-γ and GM-CSF production by gp100209-217(M) –specific T cell clones Clinical studies (melanoma patients) Vaccination Reactivity in vitro (%) to Clinical objective responses (%)   gp100(wt) gp100(M) gp100(wt) +IFA+IL-2 20 25 10 gp100(M) +IFA+IL-2 80 90 42

Ανάλογα πεπτιδίων (CEA) με αυξημένη συγγένεια για δέσμευση στον TCR Y L S G A N L N L wild type Y L S G A D L N L peptide analog (610D) Biological properties CEA605-613 CEA605-613(610D) MHC class I binding ++ ++ Lysis of indicator cells 10-2 μM 10-4 μM TAP-70 phosphorylation + ++ GM-CSF production (3ng/mL) 0,002μg/mL 0,2 μg/mL IFN-γ production (2ng/mL) 0,002 μg/mL 0,2μg/mL

Τα δενδριτικά κύτταρα ως “οχήματα”Ag Antigen loading Reinfuse in patient TNF-α Mature DCs Immature DCs Monocyte selection GM-CSF IL-4 PBMC

CEA-pulsed DCs used for vaccination of CEA+ tumor patients General Protocol day –10: FLT3 days 0 and 28: Leucapheresis days 7 and 33: DC vaccination day 58 and on: Follow-up   CTL-PRE CTL-POST CEA+-CTL-PRE CEA+-CTL-POST CEA+-CTL FOLD EXPANSION CR (n=4) 3-5 % 26-38 % 0,28-0,40 % 1,03-1,15 % 2,6-3,7 PD (n=7) 3-12 % 0-43 % 0,03-0,26 % 0,04-0,50 % 0-1,1 SD (n=2) 5-8 % 33-41 % 0,15-0,43 % 1,05-1,11 % 2,4-7,4

GARDASIL: From Bench Top to Bed-side Vaccine charasteristics non-infectious recombinant (yeast) quadrivalent (capsid prt of HPV types 6, 11, 16, 18) approved for women aged 9-26 years prevention of cervical cancer & genital wards, vulvar and vaginal precancerous lesions Clinical trials Phase I : 2,391 women, efficacy 100 % over 40 months Phase II : 552 women, efficacy 100 % over 5 years Phase III : 18,000 women, efficacy 100 % over 2 years

Τρόποι διαφυγής των καρκινικών κυττάρων από την ανοσοεπιτήρηση

Frequency of HLA class I antigen loss or down-regulation in various human cancers

Frequency of TAP loss or down-regulation in various human cancers

Σύνοψη των μηχανισμών διαφυγής καρκινικών κυττάρων από την ανοσοεπιτήρηση Failure to express MHC antigen Abnormal expression of adhesion or accessory molecules Induction of suppressor (regulatory) cells Occurence in immuno suppressed hosts Changes in T cell signal transduction molecules Decrease of and heterogeneity of TAA expression Anergy induction or clonal deletion of responding cells Utilization of products of tumor- stimulated leukocytes for tumor cell growth Secretion of immune -downregulatory soluble factors Inhibition of NK-activity by the absence of activating ligands and/or presence of inhibitory receptors