Ενόργανη Ανάλυση II Φθορισμομετρία Κοντογιάννης Χρίστος, Καθηγητής Τμήμα Φαρμακευτικής

Άδειες Χρήσης Το παρόν εκπαιδευτικό υλικό υπόκειται σε άδειες χρήσης Creative Commons. Για εκπαιδευτικό υλικό, όπως εικόνες, που υπόκειται σε άλλου τύπου άδειας χρήσης, η άδεια χρήσης αναφέρεται ρητώς. Αναφορά-Μη-Εμπορική Χρήση-Παρόμοια Διανομή

Χρηματοδότηση Το παρόν εκπαιδευτικό υλικό έχει αναπτυχθεί στα πλαίσια του εκπαιδευτικού έργου του διδάσκοντα. Το έργο «Ανοικτά Ακαδημαϊκά Μαθήματα στο Πανεπιστήμιο Πατρών» έχει χρηματοδοτήσει μόνο τη αναδιαμόρφωση του εκπαιδευτικού υλικού. Το έργο υλοποιείται στο πλαίσιο του Επιχειρησιακού Προγράμματος «Εκπαίδευση και Δια Βίου Μάθηση» και συγχρηματοδοτείται από την Ευρωπαϊκή Ένωση (Ευρωπαϊκό Κοινωνικό Ταμείο) και από εθνικούς πόρους.

Σκοπός ενότητας  Θεμελιώδεις αρχές και εφαρμογές της φθορισμομετρίας.

Περιεχόμενα ενότητας  Τι είναι ο φθορισμός;  Τύποι φασμάτων  Φάσματα διέγερσης και εκπομπής  Παράδειγμα ανθρακενίου  Ενεργειακά επίπεδα  Ηλεκτρονιακές στάθμες  Παράγοντες που επιδρούν στον φθορισμό  Οργανολογία φθορισμομετρίας  Πλεονεκτήματα της Φθορισμομετρίας έναντι της Φασματοσκοπίας  Πλεονεκτήματα φθορισμομετρίας  Μειονεκτήματα φθορισμομετρίας  Εφαρμογές

Τι είναι ο φθορισμός;  Η ενέργεια που προσλαμβάνεται κατά τη φωτοδιέγερση ενός μορίου με απορρόφηση φωτονίου δε διατηρείται στο διεγερμένο μόριο αλλά αποβάλλεται με διάφορους τρόπους, συνήθως με τη μορφή θερμότητας αλλά και με εκπομπή δευτερεύουσας ακτινοβολίας η οποία χαρακτηρίζεται με τον γενικό όρο φωταύγεια.  Η φωταύγεια χαρακτηρίζεται ως φθορισμός όταν η εκπομπή γίνεται σε χρόνο sec μετά τη διέγερση και ως φωσφορισμός όταν μεσολαβεί καθυστέρηση sec.  Το στάδιο φωτοδιέγερσης του μορίου με απορρόφηση ενός φωτονίου ακολουθεί η αποβολή ενέργειας και επαναφορά των διεγερμένων ηλεκτρονίων στη βασική κατάσταση.

Τύποι φασμάτων  Δύο τύπους φασμάτων: 1)φάσμα διέγερσης: Το σύνολο των φωτονίων που μπορούν να διεγείρουν το μόριό μας από τη θεμελιώδη στη διεγερμένη κατάσταση. 2)Φάσμα εκπομπής: Το σύνολο των μηκών κύματος των φωτονίων όταν αυτά εκπέμπουν, δηλαδή αποδιεγείρονται.  Κάθε φθορίζουσα ουσία έχει χαρακτηριστικά φάσματα απορρόφησης/εκπομπής Οι κορυφές του φάσματος εκπομπής βρίσκονται σε μεγαλύτερα λ από αυτές του φάσματος διέγερσης (τα ηλεκτρόνια για τη διέγερσή τους απαιτούν μεγαλύτερη ενέργεια από όση ελευθερώνεται πάλι με τη μορφή ακτινοβολίας.

Φάσματα διέγερσης και εκπομπής Φάσμα διέγερσης  Απεικόνιση ακτινοβολίας φθορισμού F σε συνάρτηση του μήκους κύματος της ακτινοβολίας διέγερσης.  Το φάσμα διέγερσης λαμβάνεται με τοποθέτηση του μονοχρωμάτορα φθορισμού στο μήκος κύματος όπου έχουμε μέγιστη τιμή του F (λmax)και σάρωση με τον μονοχρωμάτορα διέγερσης, με σύγχρονη μέτρηση του F. Φάσμα εκπομπής  Απεικόνιση ακτινοβολίας φθορισμού F σε συνάρτηση του μήκους κύματος της ακτινοβολίας εκπομπής.  Το φάσμα εκπομπής λαμβάνεται με τοποθέτηση του μονοχρωμάτορα διέγερσης στο μήκος κύματος όπου το F είναι μέγιστο(λmax) και σάρωση με τον μονοχρωμάτορα φθορισμού, με σύγχρονη μέτρηση του F. Το λmax είναι χαρακτηριστικό για κάθε ένωση

Παράδειγμα ανθρακενίου  Από το σχήμα φαίνονται: 1.Η σχέση ειδώλου-αντικειμένου των δύο φασμάτων 2.Η μετατόπιση του φάσματος εκπομπής προς μεγαλύτερα μήκη κύματος 3.Η εμφάνιση μίας μόνο καμπύλης στο φάσμα εκπομπής (με τρεις κορυφές) έναντι δύο ζωνών στο φάσμα διέγερσης 4.Η σύμπτωση των δύο φασμάτων σε μήκος κύματος 375nm αντιστοιχεί σε επιστροφή ηλεκτρονίων από το μηδενικό σημείο ταλάντωσης της S1 στην S0.

Ενεργειακά επίπεδα  Απορρόφηση ενέργειας : το μόριο μεταβαίνει από τη θεμελιώδη απλή κατάσταση(S0) σε διεγερμένες απλές δονητικές στάθμες(S1,S2), που είναι επιτρεπόμενες (απορρόφηση).  Αποβολή ενέργειας με μετάπτωση e- στη χαμηλότερη δονητική στάθμη της διεγερμένης κατάστασης(δονητική επαναφορά).  Εσωτερική μετατροπή ενέργειας από τη χαμηλότερη δονητική στάθμη της κατάστασης σε υψηλότερη δονητική στάθμη χαμηλότερης ηλεκτρονιακής κατάστασης(εσωτερική μετατροπή).  Εκπομπή ακτινοβολίας κατά τη μετάπτωση μεταξύ των S1,2 και της S0.(φθορισμός).  Αποδιέγερση τριπλής κατάστασης με εκπομπή ακτινοβολίας (φωσφορισμός).  Διασυστημική διασταύρωση(είναι απαγορευμένη, αν και παρουσιάζεται ελάχιστες φορές).

Ενεργειακά επίπεδα  Το εκπεμπόμενο φως είναι χαμηλότερης ενέργειας και μεγαλύτερου μήκους κύματος από το απορροφημένο φως. Αυτό σημαίνει ότι το χρώμα του φωτός που εκπέμπεται είναι διαφορετικό από το χρώμα του φωτός που απορροφήθηκε.  Μετά την εκπομπή του φωτός το φθορίζον μόριο επανέρχεται στην χαμηλή αρχική ενεργειακή του κατάσταση (ground state). Το μόριο μπορεί να απορροφήσει φωτόνιο ξανά και να περάσει από την διαδικασία του φθορισμού πολλαπλές φορές. Το γεγονός αυτό καθιστά τον φθορισμό μια πολύ ευαίσθητη τεχνική ανίχνευσης ακόμη και μικροσκοπικών ποσοτήτων.  Στην πραγματικότητα όμως το φθορίζον μόριο λόγω της αστάθειάς του στο στάδιο διέγερσης, αποδομείται και διασπάται έτσι ώστε να μη μπορεί να φθορίσει ξανά, αυτό ονομάζεται φωτολεύκανση.

Ηλεκτρονιακές στάθμες  Απλή διεγερμένη κατάσταση: Το ηλεκτρόνιο στο υψηλότερο ενεργειακό τροχιακό έχει την αντίθετη κατεύθυνση περιστροφής ως προς το δεύτερο ηλεκτρόνιο στο κάτω τροχιακό. Για να επιστρέψει στη θεμελιώδη κατάσταση από μια απλή διεγερμένη κατάσταση δεν απαιτείται κανένα ηλεκτρόνιο να αλλάξει τον προσανατολισμό του σπιν.  Κατάσταση τριπλέτας: Αυτά τα ηλεκτρόνια είναι αταίριαστα, δηλαδή, οι περιστροφές τους έχουν τον ίδιο προσανατολισμό. Απαιτείται μια αλλαγή στον προσανατολισμό περιστροφής για μια τριπλή κατάσταση προκειμένου να επιστρέψει στην απλή κατάσταση του εδάφους.

Παράγοντες που επιδρούν στον φθορισμό  Απαραίτητη προϋπόθεση για την εμφάνιση φθορισμού είναι η ύπαρξη τέτοιας δομής στο μόριο, ώστε να απορροφάται ακτινοβολία στο υπεριώδες ή το ορατό. Κατά κανόνα φθορίζουν οι ενώσεις που περιέχουν αρωματικούς πυρήνες ή πολλαπλούς συζυγιακούς διπλούς δεσμούς. Ηλεκτρονιοδότες, όπως οι ομάδες –NH2, -OH, αυξάνουν το φθορισμό (γιατί διευκολύνουν τη μετάπτωση S1 S0). Ηλεκτρονιόφιλες ομάδες, όπως –COOH, -NO2, μειώνουν ή και εξαλείφουν το φθορισμό.

Παράγοντες που επιδρούν στον φθορισμό Ξένα μόρια η ύπαρξη ξένων μορίων συνεπάγεται αλλοίωση της έντασης φθορισμού, όταν αυτά απορροφούν ακτινοβολία διέγερσης ή φθορισμού ή φθορίζουν από μόνα τους Θερμοκρασία αύξησή της συνεπάγεται μείωση της έντασης φθορισμού, γιατί η αυξανόμενη τυχαία κίνηση των μορίων αυξάνει την πιθανότητα συγκρούσεων μεταξύ των μορίων, άρα την αποδιέγερσή τους με έκλυση θερμότητας. Οξυγόνο λόγω της οξείδωσης που προκαλεί μπορεί να μετατρέψει την ουσία μας σε μη φθορίζον προϊόν.

Οργανολογία φθορισμομετρίας  Δύο τύποι: φθορισμόμετρα και φασματοφθορισμόμετρα, αναλόγως αν αποτελούνται από φίλτρα ή από μονοχρωμάτορες αντίστοιχα. Η ακτινοβολία εκπέμπεται από την πηγή φωτός. Διέρχεται από ένα φίλτρο διεγέρσεως το οποίο επιτρέπει τη δίοδο της δέσμης που θα χρησιμοποιηθεί για τη διέγερση των μορίων. Η ακτινοβολία φθορισμού εκπέμπεται από το δείγμα προς όλες τις κατευθύνσεις. Διέρχεται από το φίλτρο φθορισμού το οποίο επιτρέπει μόνο την ταινία φθορισμού. Προσπίπτει στον ανιχνευτή (φωτοκύτταρο ή φωτοπολλαπλασιαστής).

Οργανολογία φθορισμομετρίας  Πηγές Φωτός:  Τα κυριότερα στοιχεία ποιότητας μιας πηγής φωτός είναι η σταθερότητα και η έντασή της.  Απαιτείται ισχυρότερη πηγή από τη λυχνία βολφραμίου ή υδρογόνου του UV. Τόξου υδραργύρου υψηλής πιέσεως με εντονότερη γραμμή στα 366nm. Τόξου υδραργύρου χαμηλής πιέσεως με εντονότερη γραμμή στα 254nm Τόξου υδραργύρου υψηλής πιέσεως με επικάλυψη φωσφόρου με φάσμα εκπομπής από nm και μέγιστο στα 365nm Τόξου αερίου ξένου με φάσμα εκπομπής από nm και μέγιστο στα 470nm. Lasers.

Οργανολογία φθορισμομετρίας  Επιλογείς μήκους κύματος:  Χρησιμοποιούνται φίλτρα υάλου στα φθορισμόμετρα και φράγματα στα φασματοφθορισμόμετρα.  Κατά τη λήψη φάσματος διεγέρσεως πρέπει το εύρος των σχισμών του μονοχρωμάτορα διεγέρσεως να είναι μικρό(καλή διαχωριστικότητα) και του μονοχρωμάτορα εκπομπής μεγάλο(υψηλή ευαισθησία).

Οργανολογία φθορισμομετρίας  Ανιχνευτές: Φωτοπολλαπλασιαστές.  Κυψελίδες: Από ύαλο η χαλαζία. Ο θάλαμος είναι επιμελώς μαυρισμένος εσωτερικά ώστε να απορροφά οποιαδήποτε άλλη ακτινοβολία.

Πλεονεκτήματα της Φθορισμομετρίας έναντι της Φασματοσκοπίας  Με τη Φθορισμομετρία είναι δυνατό να κάνουμε: Ποσοτική Ανάλυση(μέτρηση της έντασης φθορισμού) Ποιοτική ανάλυση (το φάσμα είναι χαρακτηριστικό των μορίων) Πλεονεκτεί ως προς την ευαισθησία και εκλεκτικότητα.  Ευαισθησία: Έως 10-12Μ (Φασματοσκοπία το πολύ έως 10-9Μ)

Πλεονεκτήματα φθορισμομετρίας Μεγάλη ευαισθησία Εκλεκτικότητα(μικρό ποσοστό ουσιών που απορροφούν στο υπεριώδες ή το ορατό φθορίζει) Μεγάλο όριο ανίχνευσης Μεγάλη πειραματική ευελιξία(έχουμε δύο είδη φασμάτων)

Μειονεκτήματα φθορισμομετρίας Ανεπιθύμητες αλληλεπιδράσεις των διεγερμένων μορίων Σχετικά μικρή ακρίβεια Περιορισμένος αριθμός ουσιών που μπορούν να προσδιοριστούν(λίγες ουσίες φθορίζουν)

Φθορίζουσες χρωστικές  Είναι χρωστικές που όταν δέχονται φωτεινή ενέργεια (πχ από Laser) ενός συγκεκριμένου μήκους κύματος εκπέμπουν σε μεγαλύτερο μήκος πολύ γρήγορα nanosec.  Οι πιο σημαντικές ιδιότητες μιας φθορίζουσας ουσίας είναι το φάσμα διέγερσης και εκπομπής (absorption & emission spectrum), ο συντελεστής απόσβεσης (extinction coefficient), η κβαντική απόσβεση (quantum efficiency) και η κβαντική απόδοση (quantum yield).  Ως κβαντική απόδοση φθορίζουσας ουσίας ορίζεται ο λόγος του αριθμού των φωτονίων που παράγονται, εκπέμπονται προς τον λόγο των φωτονίων που απορροφώνται. Η μέγιστη κβαντική απόδοση μιας φθορίζουσας χρωστικής είναι το 1.0 (100%)  Ως απόσβεση ορίζουμε κάθε διαδικασία που μειώνει την ένταση του φθορισμού μιας ουσίας.

Εφαρμογές

Βιβλιογραφία  Το υλικό της παρουσίασης προέρχεται από το εξής σύγγραμμα: >, Sixth Edition, authors: Douglas A. Skoog, F. James Holler, and Stanley R. Crouch

Σημείωμα Αναφοράς Copyright Πανεπιστήμιο Πατρών, Κοντογιάννης Χρίστος «Φθορισμομετρία». Έκδοση: 1.0. Πάτρα Διαθέσιμο από τη δικτυακή διεύθυνση:

Σημείωμα Αδειοδότησης Το παρόν υλικό διατίθεται με τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Αναφορά, Μη Εμπορική Χρήση Παρόμοια Διανομή 4.0 [1] ή μεταγενέστερη, Διεθνής Έκδοση. Εξαιρούνται τα αυτοτελή έργα τρίτων π.χ. φωτογραφίες, διαγράμματα κ.λ.π., τα οποία εμπεριέχονται σε αυτό και τα οποία αναφέρονται μαζί με τους όρους χρήσης τους στο «Σημείωμα Χρήσης Έργων Τρίτων». [1] Ως Μη Εμπορική ορίζεται η χρήση: που δεν περιλαμβάνει άμεσο ή έμμεσο οικονομικό όφελος από την χρήση του έργου, για το διανομέα του έργου και αδειοδόχο που δεν περιλαμβάνει οικονομική συναλλαγή ως προϋπόθεση για τη χρήση ή πρόσβαση στο έργο που δεν προσπορίζει στο διανομέα του έργου και αδειοδόχο έμμεσο οικονομικό όφελος (π.χ. διαφημίσεις) από την προβολή του έργου σε διαδικτυακό τόπο Ο δικαιούχος μπορεί να παρέχει στον αδειοδόχο ξεχωριστή άδεια να χρησιμοποιεί το έργο για εμπορική χρήση, εφόσον αυτό του ζητηθεί

Διατήρηση Σημειωμάτων Οποιαδήποτε αναπαραγωγή ή διασκευή του υλικού θα πρέπει να συμπεριλαμβάνει:  το Σημείωμα Αναφοράς  το Σημείωμα Αδειοδότησης  τη δήλωση Διατήρησης Σημειωμάτων  το Σημείωμα Χρήσης Έργων Τρίτων (εφόσον υπάρχει) μαζί με τους συνοδευόμενους υπερσυνδέσμους.

Τέλος Ενότητας