ΟΡΟΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΗ ΤΩΝ ΛΟΙΜΩΞΕΩΝ Μπάκα Σταυρούλα Αν. Καθηγήτρια

Η διάγνωση μιας λοίμωξης επιτυγχάνεται με 3 τρόπους: 1. Με την απομόνωση του παθογόνου μικροβίου από τον οργανισμό του ασθενούς: άμεση ανίχνευση των μικροβιακών κυττάρων σε κλινικό υλικό ανίχνευση αντιγόνων ή γενετικού υλικού του μικροβίου καλλιέργεια σε τεχνητά θρεπτικά υλικά ή πειραματόζωα 2. Με την απομόνωση σε κλινικό δείγμα ειδικών μεταβολικών προϊόντων του μικροβίου που παράγονται μόνον όταν ο μικροοργανισμός είναι παρών στον οργανισμό του ασθενούς και πολλαπλασιάζεται 3. Με την ανίχνευση στον ορό του ασθενούς προϊόντων ειδικής ανοσολογικής απάντησης έναντι του παθογόνου (ΕΜΜΕΣΗ ή ΟΡΟΛΟΓΙΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ)

κυρίως ενδιαφέρουν και προσδιορίζονται τα ΕΙΔΙΚΑ Αbs IgM και IgG 3. Με την ανίχνευση στον ορό του αίματος του ασθενούς προϊόντων ειδικής ανοσολογικής ανταπόκρισης έναντι του παθογόνου μικροβίου (ΕΜΜΕΣΗ ή ΟΡΟΛΟΓΙΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ) για πρακτικούς λόγους ενδιαφέρουν κυρίως τα προϊόντα της χυμικής ανοσίας, δηλ. τα Αbs σε ξενιστή με φυσιολογικό ανοσοποιητικό σύστημα, σχεδόν κάθε λοίμωξη οδηγεί σε παραγωγή ΕΙΔΙΚΩΝ Abs έναντι συγκεκριμένων Ags του μικροβιακού αιτίου κυρίως ενδιαφέρουν και προσδιορίζονται τα ΕΙΔΙΚΑ Αbs IgM και IgG η ορολογική διάγνωση προσφέρει σημαντική βοήθεια: στη διάγνωση μιας πρόσφατης λοίμωξης στη διάγνωση λοιμώξεων στις οποίες η απομόνωση του αιτιολογικού παράγοντα είναι δύσκολη ή πρακτικά αδύνατη (π.χ. ιοί, παράσιτα) στην παρακολούθηση της ανοσολογικής απόκρισης σε περίπτωση εμβολιασμού στην παρακολούθηση του θεραπευτικού αποτελέσματος

ΕΤΕΡΟΓΕΝΕΙΑ ΤΩΝ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΩΝ Το ανοσοποιητικό σύστημα του ανθρώπου αναγνωρίζει και παράγει αντισώματα έναντι τεράστιου αριθμού διαφορετικών αντιγόνων (≈ 1015 αντιγόνα). Ο αριθμός των γονιδίων που θα απαιτούνταν για την κωδικοποίηση αυτής της τεράστιας ποικιλίας θα καταλάμβανε θεωρητικά ένα μεγάλο μέρος του DNA του ατόμου. Η εργασία του Ιάπωνα ανοσολόγου Susumu Tonegawa, για την οποία βραβεύτηκε με Nobel το 1987, έδειξε πως αυτή η ετερογένεια επιτυγχάνεται μόνο με μια ομάδα περίπου εκατό γονιδίων.

Τίτλος (ΕΙΔΙΚΩΝ) Abs είναι η μεγαλύτερη αραίωση του ορού του ασθενούς στην οποία είναι ανιχνεύσιμα τα (ΕΙΔΙΚΑ) Abs με τις ορολογικές μεθόδους στην εργαστηριακή πράξη, χρησιμοποιούνται υποδιπλάσιες αραιώσεις του ορού του ασθενούς σε Φ.Ο., δηλαδή 1:2, 1:4, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128 κ.ο.κ. ο τίτλος των Abs είναι συνάρτηση της ευαισθησίας της μεθόδου ο τίτλος των Abs μεταβάλλεται με το χρόνο της λοίμωξης και την εφαρμογή αντιμικροβιακής θεραπείας

Κυτταρομεγαλοϊός (CMV) ή ερπητοϊός 5 του ανθρώπου Είναι ένας μεγάλος σε μέγεθος DNA ιός, μέλος της ομάδας των ερπητοϊών, που απομονώθηκε για πρώτη φορά το 1956. Ο CMV παραμένει σε λανθάνουσα κατάσταση μέσα στα λευκοκύτταρα (μονοκύτταρα, ουδετερόφιλα και Τ λεμφοκύτταρα). Όταν ο CMV μολύνει ένα κύτταρο δημιουργούνται χαρακτηριστικά έγκλειστα, γνωστά ως «μάτια της κουκουβάγιας». Το μέγεθος του κυττάρου αυξάνει = κυτταρομεγαλοϊός.

Διαγνωστικές Μέθοδοι Στην περίπτωση του ιού CMV, η μέθοδος PCR, η ανίχνευση του pp-65 αντιγόνου και η κυτταροκαλλιέργεια αποτελούν μεθόδους ελέγχου της ιαιμίας και θεωρούνται καλύτεροι δείκτες για την διάγνωση της λοίμωξης. Ωστόσο, οι παραπάνω μέθοδοι: είναι τεχνικά πολύπλοκες και κάποιες απαιτούν αρκετό χρόνο για την ολοκλήρωσή τους δεν είναι σε θέση να διευκρινίσουν αν πρόκειται για πρωτολοίμωξη ή ενεργοποίηση παλαιότερης λοίμωξης

Οι περισσότερες λοιμώξεις των εγκύων είναι ασυμπτωματικές ακόμα και στην οξεία φάση. Λιγότερο από 5 % είναι συμπτωματικές στην οξεία φάση. Η απομόνωση του CMV στον ορό της μητέρας ή η ανίχνευσή του με μοριακές τεχνικές (PCR) δεν είναι πάντα εύκολη και εξαρτάται από τη χρονική στιγμή της εξέτασης (Lazzarotto et al, 2004). Οι ορολογικές δοκιμασίες έχουν εξαιρετική σημασία για τη διάγνωση. Συνήθως η παρουσία anti-CMV IgM αντισωμάτων χρησιμοποιείται για τη διάγνωση μιας οξείας ή πρόσφατης λοίμωξης.

Secondary Infection/ Reactivation (Secondary infection/Reactivation) Λοίμωξη CMV Το anti-CMV IgG avidity test είναι αυτή τη στιγμή η πιο αξιόπιστη μέθοδος για να διαχωρίσουμε την αρχική λοίμωξη από επαναλοιμώξεις. Anti-CMV IgG CMV -Avidity Amount of IgG / IgM Antibody or Avidity Anti-CMV IgM Primary infection Anti-CMV IgM Secondary Infection/ Reactivation Time of infection First CMV-M and –G positive bleeds CMV-M positive (Secondary infection/Reactivation) time

Anti-CMV IgG avidity τεστ Το avidity δείχνει την ωρίμανση της ανοσιακής απάντησης. Έτσι, χαμηλός δείκτης avidity υποδηλώνει παρουσία anti-CMV IgG με χαμηλό avidity στον ορό, αποτέλεσμα μιας οξείας ή πρόσφατης πρωτολοίμωξης, και αντίθετα, υψηλός δείκτης avidity υποδηλώνει παρουσία anti-CMV IgG με υψηλό avidity στον ορό, ενδεικτικά μη ενεργούς λοίμωξης. Χαμηλό δείκτη avidity συναντάμε 18-20 εβδομάδες μετά την έναρξη συμπτωμάτων σε ανοσοϊκανά άτομα. Ο προσδιορισμός του anti-CMV IgG avidity πριν την 16η -18η εβδομάδα κυήσεως θα εντοπίσει όλες τις γυναίκες με συγγενή λοίμωξη του εμβρύου/νεογνού και έχει ευαισθησία 100 % (Lazzarotto et al, 2000). Yψηλός δείκτης avidity κατά τις πρώτες 12-16 εβδομάδες της κυήσεως θεωρείται ενδεικτικός παλαιάς λοίμωξης.

Μη πρόσφατη/παλαιά Λοίμωξη* CMV: Απουσία Λοίμωξης CMV IgG CMV IgM Ασθενής 1 - CMV IgG Avidity N/A Ερμηνεία Μη πρόσφατη/παλαιά Λοίμωξη* *δεν αποκλείει πολύ πρόσφατη λοίμωξη ή επαφή με τον ιό

CMV: Παλαιά Λοίμωξη + - CMV IgG CMV IgM Ασθενής 2 CMV IgG Avidity N/A Ερμηνεία Μη πρόσφατη Λοίμωξη

CMV: Ερμηνεία Θετικών IgG/IgM χωρίς avidity CMV IgM Ασθενής 3 + Ασθενής 4 CMV IgG Avidity N/A Ερμηνεία Πρώϊμη Λοίμωξη ή Επανενεργοποίηση; ?? ??

CMV: Ερμηνεία Θετικών IgG/IgM με avidity CMV IgM Ασθενής 3 + Ασθενής 4 CMV IgG Avidity Low High Ερμηνεία Πρωτολοίμωξη Επανενεργοποίηση Patient 3 Patient 4

CMV: Αλγόριθμος

Η τοξοπλάσμωση είναι μια λοίμωξη που προκαλείται από το υποχρεωτικά ενδοκυττάριο πρωτόζωο Toxoplasma gondii. Η λοίμωξη στον άνθρωπο μεταπίπτει σε χρονιότητα. Το μολυσμένο κύτταρο-ξενιστής αναπτύσσει τοίχωμα και σχηματίζει κύστη που περιέχει πολυάριθμα παράσιτα. Οι κύστεις μπορεί να παραμείνουν για όλη τη ζωή, σε διάφορους ιστούς, κυρίως στους σκελετικούς μύες, μυοκάρδιο, εγκέφαλο και οφθαλμούς. Σε αυτή τη φάση τα παράσιτα ονομάζονται βραδυζωίτες, γιατί πολλαπλασιάζονται πολύ αργά και παραμένουν σε λανθάνουσα κατάσταση για χρόνια.

Οι γάτες παίζουν σημαντικό ρόλο στον κύκλο ζωής του παρασίτου, χωρίς να εμφανίσουν κλινική νόσο. Η σεξουαλική φάση του κύκλου ζωής του T. gondii γίνεται στο έντερο της γάτας η οποία αποβάλλει ωοκύστεις στα κόπρανα για 7-21 ημέρες, οι οποίες επιμολύνουν το νερό και τα τρόφιμα.

Συνήθως η τοξοπλάσμωση είναι ασυμπτωματική και η διάγνωση βασίζεται κυρίως στα αποτελέσματα των ορολογικών εξετάσεων. Ο επιπολασμός των αντισωμάτων έναντι του τοξοπλάσματος κυμαίνεται μεταξύ 5 έως 95% του νεανικού πληθυσμού και σύμφωνα με έναν υπολογισμό, πάνω από 500 εκατομμύρια άνθρωποι είναι μολυσμένοι από τοξόπλασμα στον κόσμο. Στις έγκυες γυναίκες παγκοσμίως, ο επιπολασμός κυμαίνεται από 7 έως 51,3 %. Το ιδανικό θα ήταν, κάθε γυναίκα να γνωρίζει πριν από τη σύλληψη αν έχει έρθει σε επαφή με αυτό το παράσιτο.

Ορολογικοί Δείκτες Τοξοπλάσμωσης Τα T. gondii-IgG αντισώματα παράγονται καθ’όλη την διάρκεια της ζωής μετά από την λοίμωξη. Η ανίχνευση σε κάποιο δείγμα, σε οποιονδήποτε τίτλο, αποδεικνύει ότι η μόλυνση έχει αποκτηθεί κάποια στιγμή στο παρελθόν. time Relative response 1 week 1 month 6 months 1 year 2 years Anti-Toxo IgG

Ορολογικοί Δείκτες Τοξοπλάσμωσης Τα αντισώματα IgM ανιχνεύονται σε άτομα με πρόσφατη λοίμωξη, ενώ μπορεί να παραμείνουν για ένα έτος ή περισσότερο. Ψευδώς θετικές αντιδράσεις μπορούν να βρεθούν σε ασθενείς που δεν είχαν ποτέ προσβληθεί από τοξόπλασμα (σε αυτά τα άτομα, η εξέταση για IgG παραμένει αρνητική). time Relative response 1 week 1 month 6 months 1 year 2 years Anti-Toxo IgG Anti-Toxo IgM

Ορολογικοί Δείκτες Τοξοπλάσμωσης Το IgG avidity τεστ αναπτύχθηκε για να ξεχωρίσουμε μία παλαιά από μία πρόσφατη λοίμωξη. Μετά την αντιγονική πρόκληση, τα ειδικά αντισώματα που παράγονται έχουν χαμηλό avidity (δεσμευτική ικανότητα). Κατά τη διάρκεια της ανοσιακής απάντησης, τα αντισώματα ωριμάζουν και η δεσμευτική τους ικανότητα αυξάνει προοδευτικά με τη πάροδο του χρόνου (εβδομάδες και μήνες). Το IgG avidity τεστ είναι πολύ χρήσιμη δοκιμασία, κυρίως όταν έχουμε στη διάθεσή μας μόνο ένα δείγμα ορού. time Relative response 1 week 1 month 6 months 1 year 2 years Anti-Toxo IgG Toxo IgG Avidity Anti-Toxo IgM

Ορολογικοί Δείκτες Τοξοπλάσμωσης Υψηλού avidity IgG αντισώματα αναπτύσσονται περίπου 4 μήνες μετά τη λοίμωξη. Η παρουσία υψηλού avidity IgG φανερώνει ότι η λοίμωξη εκδηλώθηκε > 4 μήνες νωρίτερα. Έτσι, σε μία έγκυο στον πρώτο τρίμηνο, ανεξάρτητα από το αποτέλεσμα των IgΜ, όταν υπάρχουν υψηλού avidity IgG, το έμβρυο δεν κινδυνεύει από συγγενή τοξοπλάσμωση. time Relative response 1 week 1 month 6 months 1 year 2 years Anti-Toxo IgG Toxo IgG Avidity Anti-Toxo IgM

Toxo Diagnostic Algorithm for Pregnant Women* time Relative response 1 week 1 month 6 months 1 year 2 years Anti-Toxo IgG Το avidity τεστ δεν πρέπει να χρησιμοποιηθεί ποτέ μόνο του για την διάγνωση, αλλά πάντα σε συνδυασμό με τα IgΜ και IgG. Toxo IgG Avidity Anti-Toxo IgM Toxo IgG, IgM testing G- M- G+ M- G+ M+ G- M+ Primary prevention Repeat testing during pregnancy Immune Past infection likely No further testing required Beginning of infection or non-specific IgM Repeat testing 2-3 weeks later Toxo IgG avidity test High avidity Infection >4 months Low or intermediate avidity Subsequent serum sample for IgG testing 3 weeks later *Interpretation is most reliable when patient is tested in 1st trimester Source: Congenital Diseases Learning Guide

ΟΡΟΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΕΣ ΔΟΚΙΜΑΣΙΕΣ Ιζηματινοαντιδράσεις Συγκολλητινοαντιδράσεις Ανοσοφθορισμός Ανοσοενζυμικές μέθοδοι

ΙΖΗΜΑΤΙΝΟΑΝΤΙΔΡΑΣΕΙΣ = αντιδράσεις αντιγόνου-αντισώματος με δημιουργία ορατού ιζήματος, το οποίο καθιζάνει όταν ενωθούν σε ισοδύναμες ποσότητες. Απαραίτητη προϋπόθεση για να συμβεί μια ιζηματινοαντίδραση είναι: Το αντιγόνο και το αντίσωμα να είναι σε διαλυτή μορφή (σε διάλυμα). Να υπάρχουν τα κατάλληλα ρυθμιστικά διαλύματα. Να υπάρχει η κατάλληλη θερμοκρασία για την ιζηματινοαντίδραση.

ΙΖΗΜΑΤΙΝΟΑΝΤΙΔΡΑΣΕΙΣ Εναλλακτικά οι ιζηματινοαντιδράσεις γίνονται και σε πηκτή αγαρόζης. Κατά την ιζηματινοαντίδραση συγκολλώνται το αντιγόνο με το αντίσωμα και σχηματίζουν την ορατή ζώνη καθίζησης (τόξο). Η μέγιστη καθίζηση συντελείται στη ζώνη ισορροπίας.

Εφαρμογές ιζηματινοαντιδράσεων Ανοσοδιάχυση: διαχωρίζει αντιδράσεις Ag-Ab από διαφορετικούς πληθυσμούς Ab. Διεξάγεται σε πηκτή αγαρόζης. Στην ακτινωτή ανοσοδιάχυση: το Ab ενσωματώνεται στην πηκτή αγαρόζης, ενώ το Ag εισάγεται σε οπή που ανοίγεται στην πηκτή. Μετράται το εύρος του δακτυλίου καθίζησης. Προσδιορίζει την παρουσία συγκεκριμένων Ag με βάση ορό γνωστής περιεκτικότητας σε Ag (κάθε Ag δίνει διαφορετικού εύρους δακτύλιο). Ανοσοηλεκτροφόρηση: διαχωρίζει τις πρωτεϊνες του ορού και αποτελεί τη βάση ορισμένων διαγνωστικών δοκιμασιών, όπως Western blot. Rocket ηλεκτροφόρηση: το Ag υποβάλλεται σε ηλεκτροφόρηση μέσα σε άγαρ όπου υπάρχει το Ab.

Τί ονομάζουμε φαινόμενο προζώνης; Φυσιολογικά, οι ιζηματινοαντιδράσεις παρατηρούνται μόνο όταν η αναλογία Ag-Ab είναι βέλτιστη. Το φαινόμενο προζώνης παρατηρείται όταν στο σύστημα της ιζηματινοαντίδρασης το Ag ή το Ab είναι σε περίσσεια. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα την απουσία σχηματισμού ορατού ιζήματος. Το φαινόμενο προζώνης διορθώνεται με αραίωση του ορού και διατήρηση σταθερής συγκέντρωσης.

ΣΥΓΚΟΛΛΗΤΙΝΟΑΝΤΙΔΡΑΣΕΙΣ Είναι η αντίδραση ενός αντιγόνου με το ομόλογό του αντίσωμα και ο σχηματισμός κροκίδων, που γίνονται ορατές με το μικροσκόπιο, με τη βοήθεια μεγεθυντικού φακού ή με γυμνό μάτι. Το αντιγόνο βρίσκεται σε εναιώρημα είτε ελεύθερο είτε προσροφημένο σε αδρανή σώματα όπως σωματίδια latex ή ερυθρά αιμοσφαίρια. Διακρίνονται: Άμεση βακτηριακή συγκολλητινοαντίδραση Συγκολλητινοαντίδραση latex Έμμεση ή παθητική αιμοσυγκόλληση Αναστολή της αιμοσυγκόλλησης

ΣΥΓΚΟΛΛΗΤΙΝΟΑΝΤΙΔΡΑΣΕΙΣ Άμεση βακτηριακή συγκολλητινοαντίδραση

ΣΥΓΚΟΛΛΗΤΙΝΟΑΝΤΙΔΡΑΣΕΙΣ Άμεση βακτηριακή συγκολλητινοαντίδραση Σε πυκνό διάλυμα, τα Abs συνδέονται με επιφανειακά μικροβιακά Ags και συγκολλούν τα μικρόβια σε μακροσκοπικά ορατούς σωρούς. συγκόλληση Wright Ag = Brucella abortus  Βρουκέλλωση (μελιταίος πυρετός) συγκόλληση Weil-Felix Ag = στελέχη Πρωτέα ΟΧ  ρικετσιώσεις συγκόλληση Widal Ag = σαλμονελλών [σωματικά (Ο) ή βλεφαριδικά (Η)]  τυφοειδής πυρετός συγκολλητινοαντιδράσεις για τουλαραιμία, λεπτοσπείρωση, τέτανο

ΣΥΓΚΟΛΛΗΤΙΝΟΑΝΤΙΔΡΑΣΕΙΣ Συγκολλητινοαντίδραση latex Σε πυκνό διάλυμα, τα Abs συνδέονται με μικροβιακά Ags που έχουν συνδεθεί τεχνητά στην επιφάνεια σωματιδίων latex και συγκολλούν τα σωματίδια σε μακροσκοπικά ορατούς σωρούς. Είναι οι ευρύτερες χρησιμοποιούμενες συγκολλητινοαντιδράσεις. Αναφέρονται ενδεικτικά μόνο μερικές: Βακτηριακές λοιμώξεις : Abs έναντι τειχοϊκών οξέων σταφυλοκόκκου Αbs αντιστρεπτοκοκκικά Abs έναντι μυκοπλασμάτων ιογενείς λοιμώξεις : Abs έναντι κυτταρομεγαλοϊού (CMV) και ερυθράς παρασιτικές λοιμώξεις : Abs έναντι T.gondii, Echinococcus, Trichinella μυκητιακές λοιμώξεις : Abs έναντι Coccidiodes, Sprorothrix

ΣΥΓΚΟΛΛΗΤΙΝΟΑΝΤΙΔΡΑΣΕΙΣ Έμμεση ή παθητική αιμοσυγκόλληση Σε πυκνό διάλυμα, τα Abs συνδέονται με μικροβιακά Ags που έχουν συνδεθεί τεχνητά στην επιφάνεια ερυθρών αιμοσφαιρίων προβάτου και συγκολλούν τα ερυθρά σε μακροσκοπικά ορατούς σωρούς. Διάγνωση της σύφιλης (MHA – TP και HATTS) Διάγνωση της ερυθράς

ΣΥΓΚΟΛΛΗΤΙΝΟΑΝΤΙΔΡΑΣΕΙΣ Αναστολή της αιμοσυγκόλλησης Οι διάφοροι ιοί συγκολλούν ερυθρά διαφορετικών ειδών, π.χ. ο ιός της ερυθράς συγκολλά ανθρώπινα ερυθρά ομάδας Ο, ερυθρά χήνας και ερυθρά κότας. Ορός ασθενούς, που περιέχει Abs έναντι συγκεκριμένου ιού, αφήνεται να αντιδράσει με σωματίδια του ιού. Η πραγματοποιούμενη σύνδεση «Ag – Ab» παρεμποδίζει τη συγκόλληση ερυθρών αιμοσφαιρίων – που προστίθενται σε δεύτερο χρόνο στο διάλυμα – από τα σωματίδια του ιού.

Αναστολή αιμοσυγκόλλησης για την ανίχνευση αντισωμάτων έναντι ιού Αναστολή αιμοσυγκόλλησης για την ανίχνευση αντισωμάτων έναντι ιού. Αυτοί οι ιοί φυσιολογικά προκαλούν αιμοσυγκόλληση, όταν αναμιχθούν με ερυθρά αιμοσφαίρια. Αν υπάρχουν αντισώματα έναντι του ιού, όπως φαίνεται εδώ, τον εξουδετερώνουν και αναστέλλουν την αιμοσυγκόλληση.

ΑΝΟΣΟΦΘΟΡΙΣΜΟΣ Χρησιμοποιείται για την ανίχνευση μικροοργανισμών σε κλινικά δείγματα και ειδικών αντισωμάτων στον ορό. Βασίζεται στην σύζευξη φθοριζουσών χρωστικών, όπως η ισοθειοκυανική φθοριοσεΐνη με αντισώματα, τα οποία φθορίζουν, όταν εκτεθούν στο υπεριώδες φώς. Η τεχνική είναι ταχεία, έχει μεγάλη ευαισθησία και ειδικότητα. Υπάρχουν δύο κατηγορίες ανοσοφθορισμού: - άμεσος (ανίχνευση μικροοργανισμών) - έμμεσος (ανίχνευση στον ορό ειδικών αντισωμάτων που παράγονται μετά από έκθεση σε συγκεκριμένο μικροοργανισμό)

Άμεσος ανοσοφθορισμός (ανίχνευση μικροοργανισμών) Το κλινικό δείγμα με το προς ταυτοποίηση αντιγόνο μονιμοποιείται σε αντικειμενοφόρο πλάκα. Προστίθενται αντισώματα σημασμένα με φθοριοσεΐνη. Επώαση για μικρό χρονικό διάστημα και πλύση για την απομάκρυνση της περίσσειας του αντισώματος που δεν έχει συνδεθεί με το αντιγόνο. Εξέταση στο μικροσκόπιο φθορισμού για κιτρινοπράσινο φθορισμό.

Έμμεσος ανοσοφθορισμός (ανίχνευση αντισωμάτων) Συχνά έχει μεγαλύτερη ευαισθησία από τον άμεσο ανοσοφθορισμό. Γνωστό αντιγόνο μονιμοποιείται σε αντικειμενοφόρο πλάκα. Προστίθεται ο υπό εξέταση ορός: εάν υπάρχει ειδικό αντίσωμα έναντι του συγκεκριμένου μικροβίου θα σχηματίσει σύμπλεγμα. Προστίθεται αντιανθρώπινη ανοσοσφαιρίνη (αντίσωμα που αντιδρά ειδικά με κάθε ανθρώπινη ανοσοσφαιρίνη) σημασμένη με φθοριοσεΐνη  για να γίνει ορατό το σύμπλεγμα αντιγόνου αντισώματος. Επώαση, πλύσιμο, εξέταση στο μικροσκόπιο φθορισμού.

Έμμεσος ανοσοφθορισμός (ανίχνευση αντισωμάτων)

Ανοσοενζυμικές μέθοδοι Η ευρύτερα χρησιμοποιούμενη ανοσοενζυμική δοκιμασία είναι η ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), διότι η ερμηνεία των αποτελεσμάτων είναι εύκολη: συνήθως είναι σαφώς θετικές ή αρνητικές. Υπάρχουν δύο βασικές μέθοδοι: άμεση ELISA  ανιχνεύει αντιγόνα έμμεση ELISA  ανιχνεύει αντισώματα Συχνά χρησιμοποιείται πλάκα μικροτιτλοποίησης με πολυάριθμα βυθίσματα αν και υπάρχουν διάφορες παραλλαγές τις μεθόδου. Διατίθενται διάφορες δοκιμασίες ELISA σε έτοιμα kit του εμπορίου, ακόμα και για χρήση από το κοινό όπως π.χ. το τεστ κυήσεως.

ΑΜΕΣΗ ELISA  ανιχνεύει αντιγόνα Ειδικά αντισώματα έναντι των φαρμάκων είναι προσροφημένα στο βύθισμα της πλάκας μικροτιτλοποίησης. Όταν προστίθεται στο βύθισμα δείγμα ούρων του ασθενούς τα φάρμακα συνδέονται με τα αντισώματα και δεσμεύονται. Ακολουθεί πλύση για την απομάκρυνση της περίσσειας του μή συνδεδεμένου φαρμάκου. Για να γίνει ορατή: προστίθενται ειδικά αντισώματα (έναντι του φαρμάκου) σημασμένα με ένζυμα, που αντιδρούν με το ήδη δεσμευμένο φάρμακο  sandwich αντίσωμα-φάρμακο-αντίσωμα σημασμένο με ένζυμα. Προστίθεται υπόστρωμα του συνδεδεμένου ενζύμου  επί θετικής δοκιμασίας το ένζυμο αντιδρά με το υπόστρωμα και παρατηρείται αλλαγή χρώματος.

ΕΜΜΕΣΗ ELISA  ανιχνεύει αντισώματα στον ορό Χρησιμοποιείται π.χ. για την ανίχνευση αντισωματών του ιού ΗΙV στο αίμα. Στην πλάκα μικροτιτλοποίησης περιέχεται αντιγόνο π.χ. αδρανοποιημένος ιός που προκαλεί τη νόσο που είναι σχεδιασμένη να διαγνώσει η μέθοδος. Δείγμα αίματος του ασθενούς, προστίθεται στο βύθισμα και αν περιέχει αντισώματα έναντι του ιού, αυτά αντιδρούν με τον ιό. Το βύθισμα πλένεται για την απομάκρυνση της περίσσειας μη συνδεδεμένων αντισωμάτων. Εάν τα αντισώματα στο αίμα συνδεθούν με τον ιό στο βύθισμα της πλάκας, θα παραμείνουν μέσα στο βύθισμα – θετική δοκιμασία. Για να γίνει ορατή η αντίδραση προστίθεται αντιανθρώπειος ανοσοσφαιρίνη σημασμένη με ένζυμο. Επί θετικής δοκιμασίας δημιουργείται σύμπλεγμα sandwich ιού-αντισώματος-σημασμένου με ένζυμο αντισώματος. Προστίθεται το υπόστρωμα του ενζύμου και η θετική δοκιμασία ανιχνεύεται με μεταβολή χρώματος που προκαλείται από τη δράση του ενζύμου.