实验 54 E.Coli 感受态细胞的制备、质粒 DNA 的转化、提取与酶切鉴定 制作人：刘如石

一. 实验目的和要求 1 、 通过本实验了解和掌握氯化钙法制备大肠杆菌感 受态细胞和质粒 DNA 转化受体菌细胞的原理与技术； 2 、了解质粒 DNA 的特性，掌握碱裂解法从大肠杆菌 细胞中分离、提取质粒 DNA 的方法； 3 、掌握限制性内切酶的特性、酶解和琼脂糖凝胶电泳 的操作方法； 通过本实验了解大肠杆菌感受态细胞制备、 DNA 转化、限制性内切酶在分子生物学研究中的意义与作 用。

二. 实验原理 1 、感受态细胞制备 : 所谓感受态是指受体细胞处 于容易吸收外源 DNA 的一种生理状态，可以通过物 理与化学方法诱导形成，也可以自然形成，在基因 工程技术中通常采用诱导的方法。用于转化的受体 菌细胞一般是限制 - 修饰系统（ Restriction- Modification ）缺陷的变异株，以防止对导入的外源 DNA 的切割，用符号 R - M - 表示。其基本原理是：细 菌处于 0 ℃的 CaCl 2 低渗溶液中，会膨胀成球形，细 胞膜的通透性发生变化，转化混合物中的质粒 DNA 形成抗 DNase 的羟基 - 钙磷酸复合物黏附于细胞表面， 经

过 42 ℃短时间的热激处理，促进细胞吸收 DNA 复合物， 在丰富的培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分 裂增殖，在选择培养基上可获得所需的转化子。 2 、碱裂解法小量制备质粒 DNA ：碱裂解法是基于 线性大分子染色体 DNA 与小分子环形质粒 DNA 的变性 复性的差异达到分离目的的，在 pH12.0 ～ 12.6 的碱性 环境中，线型染色体 DNA 和环型质粒 DNA 氢键会发生 断裂，双链解开而变性，但质粒 DNA 由于其闭合环型 结构，氢键仅发生部分断裂，而且其互补链不完全分 离；当将 pH 值调节到中性并在高盐浓度下，已分开的 染色体 DNA 互补链不能复性而交联形成不溶的网状结 构，通过离心，大部分染色体 DNA 、不稳定的大分子

RNA 和蛋白质 -SDS 复合物等一起沉淀下来而被除去，而 部分变性的闭合环状的质粒 DNA 在中性条件下很快复性， 恢复到原来的构型，呈可溶性状态保存与溶液中，离心 后上清中便含有所需要的质粒 DNA 。 根据限制酶的识别切割特性， 催化条件及是否具 有修饰酶活性可分为Ⅰ、Ⅱ、 III 型三大类，Ⅰ类和 III 类 限制性内切酶，在同一蛋白分子中兼有甲基化作用及依 赖 ATP 的限制性内切酶活性。Ⅰ类限制性内切酶结合于 特定识别位点，但却随机地切割回转到被结合 3 、限制性内切酶：又称为内切酶或限制酶，是一 类能识别双链 DNA 分子特异性核酸序列的 DNA 水解酶， 是体外剪切基因片段的重要工具，主要存在于原核生物 中。根据限制酶的识别切割特性， 催化条件及是否具 有修饰酶活性可分为Ⅰ、Ⅱ、 III 型三大类，Ⅰ类和 III 类 限制性内切酶，在同一蛋白分子中兼有甲基化作用及依 赖 ATP 的限制性内切酶活性。Ⅰ类限制性内切酶结合于 特定识别位点，但却随机地切割回转到被结合

处的 DNA 。Ⅲ类限制性内切酶在识别位点上切割，然后 从底物上解离下来。故Ⅰ类和Ⅲ限制酶在基因工程中基 本不用， II 类酶在分子克隆中使用广泛，其基本特点如 下： 处的 DNA 。Ⅲ类限制性内切酶在识别位点上切割，然后 从底物上解离下来。故Ⅰ类和Ⅲ限制酶在基因工程中基 本不用， II 类酶在分子克隆中使用广泛，其基本特点如 下： (1) 、专一性地识别并切割特定的核苷酸序列，如 EcoR I 识别与切割序列为 5`····GAATTC····3` (1) 、专一性地识别并切割特定的核苷酸序列，如 EcoR I 识别与切割序列为 5`····GAATTC····3` 3`····CTTAAG····5` 3`····CTTAAG····5` (2) 、识别的核苷酸数目大多数为 4 ～ 6 个，少数识别 8 ～ 13 个； (2) 、识别的核苷酸数目大多数为 4 ～ 6 个，少数识别 8 ～ 13 个； (3) 、识别序列大多数为二重对称（回文序列），大 多数酶产生的是具有凸出的粘性末端： (3) 、识别序列大多数为二重对称（回文序列），大 多数酶产生的是具有凸出的粘性末端：

(4) 、有不同来源的限制性内切酶可以识别相同的序列， 甚至切割的位点也相同，称为同裂酶或异源同工酶，如 Hpa II 与 Msp I ；有的识别位点不同，但对 DNA 切割后可 产生相同的粘性末端，称为同尾酶，如 BamH I 与 Bgl II 。

影响核酸限制性内切酶活性的因素 ： DNA 的纯度； DNA 的甲基化程度； 酶切消化反应的温度； DNA 的分子结构；溶液中离子浓度及种类； 缓冲液的 pH 值。 4 、琼脂糖凝胶电泳 : 琼脂糖溶化再凝固后能形成 带具有一定形状、大小与孔隙度的固体基质 ( 密度与琼 脂糖浓度相关 ) ；而生理条件下，核酸分子的糖 - 磷酸 骨架中磷酸基团呈离子化状态，因此将核酸分子置于 电场中时，它们会向正极迁移，由于糖 - 磷酸骨架在结 构上的重复性，相同数量的双链 DNA 几乎具有等量的 净电荷，因此他们能以同样的速度向正极方向迁移。 在一定的电场强度下， DNA 分子的迁移率取决于核酸 分子本身的大小和构象。分子量较小的 DNA 分子，比 分子量较大的 DNA 分子，具有较紧密的构型，所以其 电泳迁移速率也就比同等分子量的松散型的开环 DNA 分子或线性 DNA 分子要快。直接用低浓度的 EB 进行染

色，可确定 DNA 在胶中的位置。 影响琼脂糖凝胶电泳 DNA 迁移率的因素： DNA 的分子大小； 琼脂糖浓度； DNA 构象； 电场强度； 碱基组成与温度；嵌入染料的存在；电泳缓冲液的组成。 三．实验材料与设备： 1 、用品与与仪器： 超净工作台、电热恒温水浴、分光光度计、恒温培养箱、 恒温振荡器、移液器、微型离心管等、台式冷冻高速离心 机、旋涡震荡器、电泳仪、电泳槽、紫外透射仪，凝胶成 像仪、冰箱、制冰机等； 1.5mL 与 0.5mL Eppendorf 管、 tip 头 、烧杯、量筒

镊子、试管三角瓶、玻璃涂棒、酒精灯、无菌牙签、 吸水纸，一次性塑料手套等； E.coli DH5α 受体菌 (R - M - ) ， pGEX-PDIP-r 质粒 (AmpR) 2 、试剂： LB 培养基 : 蛋白胨 10g/L ，酵母提取物 5g/L ， NaCl 10g/L ，琼脂粉 15g/L （固体培养基），用 10 mol/L 的 NaOH 调节 pH 为 7.0 ，高压灭菌； 氨苄青霉素贮存液：浓度 mg ／ mL ； 含有抗菌素的 LB 平板培养基：将配置好的 LB 固体培养 基高压灭菌后，冷却到 60 度左右，加入氨苄青霉素（终 浓度为 50µg ／ mL 浓度 µg ／ mL ）；

0.1mol/LCaCl 2 ：称取 1.1g 进口无水 CaCl 2 ，溶于 70mL 双蒸水中，定容到 100mL ，过滤后灭菌； 0.1mol/LCaCl 2 15 ％甘油： 100ml 0.1mol/L CaCl 2 溶液内含有 15ml 甘油，高压灭菌； 溶液 I: 50mmol/L 葡萄糖， 10mmol/L EDTA (pH8.0) ， 25mmol/L Tris-HCl (pH8.0) ； 溶液 II: 0.2mol/L NaOH, 1%SDS ( 现配现用 ) ； 溶液 III: 乙酸钾溶液 (3M, pH=4.8)( 60mL 的 5mol/L KAc, 11.5ml 冰醋酸， 28.5mL H2O) ； RNase A ： 10mg/ml ； TE 缓冲液 : 10mmol/L ， Tris-HCl, 1mmol/L ， EDTA ， pH8.0 ；

5×TBE 缓冲液： 0.45mol/L Tris －硼酸， 0.01 mol/L EDTA, pH 8.0 ； 10×Loading buffer ： 1% SDS, 0.05% 溴酚兰， 50 ％ 的甘油； 无水乙醇； 70 ％乙醇； 标准分子量片段； 核酸内切酶 EcoR I (TaKaRa) ； EcoR I 酶解缓冲液 (10× buffer H) ； 琼脂糖； 溴化乙啶（ EB ）染色液 (10mg/ml) 。

四．操作步骤 : ( 一 ) 感受态细胞的制备： 1 、从新活化的 E.coli DH5α 平板上挑取一单菌落，接 种于 3 ～ 5ml LB 液体培养中， 37 ℃振荡培养至对数生长 期 ( 12h 左右 ) ； 2 、将该菌悬液以 1:100 ～ 1:50 转接于 100ml LB 液体培 养基中， 37 ℃振荡扩大培养，当培养液开始出现混浊后， 每隔 20 ～ 30min 测一次 OD 600 ，至 OD 600 为 0.3 ～ 0.5 时停 止培养，并转装到 1.5 mL 离心管中； 3 、培养物于冰上放置 20min ； 4 、 0 ～ 4 ℃， 4000g 离心 10min ，弃去上清液，加入 1 mL 冰冷的 0.1mo1 ／ L CaCl 2 溶液，小心悬浮细胞, 冰浴 20 分钟；

CaCl 2 纯度至关重要，不同厂家， 甚至同一厂家不同批号的产品均影响感受态的转化效率 5 、 0 ～ 4 ℃， 4000g 离心 10min ，倒净上清培养液， 再用 1.0 mL 冰冷的 0.1mo1 ／ L CaCl 2 溶液轻轻悬浮细胞， 冰浴 20min ； 6 、 0 ～ 4 ℃， 4000g 离心 10min ，弃去上清液，加入 100 µL 冰冷的 0.1mo1 ／ L CaCl 2 溶液，小心悬浮细胞， 冰上放置片刻后，即制成了感受态细胞悬液； 8 、制备好的感受态细胞悬液可直接用于转化实验，如 果在 4 ℃放置 12 ～ 24h ，其转化效率可以增高 4 ～ 6 倍；也 可加入占总体积 15 ％左右高压灭菌过的甘油，混匀后分 装于 1.5ml 离心管中，置于 -70 ℃条件下，可保存半年至 一年。

（二）质粒 DNA 的转化： 1 、每 100µL 感受态细胞悬液中加入 1µL 质粒 DNA, 轻轻 摇匀，同时设置三组对照： (1) 不加质粒， (2) 不加受体菌， (3) 加已知具有转化活性的质粒 DNA ，具体操作按下表进 行： * 阳性对照，用已知具有转化活性的 pGEX-PDIP-r 质粒 DNA 进行转化 编号 组 别 质粒 DNA/μL TE buf / μL 0.1mol/L CaCl 2 / μL 受体菌 / μL 1受体菌对照——1——100 2质粒对照 1 （ μg ） ——100 3 转化组 I 1 （ μg ） ————100 4 转化组 II * 1 （ μg ） ————100

2 、冰上放置 20 ～ 30min ，然后 42 ℃水浴热激 90 ～ 120 Sec ，迅速冰上冷却 2min ； 3 、 立即向上述 Ep 管中加入 0.8mL LB 液体培养基， 摇匀后于 37 ℃振荡培养约 15 ～ 30min ，使受体菌恢复正 常生长状态及表达抗性基因； 4 、取培养液 50µL 接种于含抗菌素的 LB 平板培养 基上，用玻璃涂棒涂匀； 5 、将培养皿放在 37 ℃恒温培养箱培养 30 min, 待菌 液完全被培养基吸收后，倒置培养皿，于 37 ℃恒温培养 箱内培养过夜 (14-16h) ； （三）碱裂解法小量制备质粒 DNA:

1 、挑取转化筛选的带有目的质粒的大肠杆菌接种到 液体培养基中， 37 ℃震荡培养 12 ～ 16 小时； 2 、将 1.5mL 菌液加入 Ep 离心管中， g 离心 30 Sec ，弃上清液，在吸水纸上扣干； 离心时间不能太长，以免影响下一步的菌体悬浮 3 、加入 100  L 预冷的溶液 I ，于涡旋振荡器上振荡 悬浮细菌细胞，尽量使细胞分散； 溶液 I 中的葡萄糖的作用是增大让一让的粘度，减少提取 过程中的机械剪切力，防止染色体 DNA 的断裂； EDTA 的作 用是与二价离子（ Ca 2 ＋ ）结合，降低 DNase 对 DNA 的降解。 4 、加入 200  L 新配制的溶液 II, 盖紧管口, 快速颠倒 离心管, 以混匀内容物, 冰上放置 3 － 5min; 溶液 II 中的 NaOH 与 SDS 可裂解细胞，使 DNA 变 性以及 SDS 使蛋白变性并形成交联的网状结构

5 、加入 150  l 溶液 III, 加盖后颠倒 6-7 次混匀，冰上放 置 2 ～ 3min ； 溶液 III 为低 pH 的醋酸钾缓冲液，中和 NaOH ，以便使部 分变性的闭环质粒复性，而细菌染色体 DNA 不能正确复性 6 、 g 离心 6 min ，将上清移入另一干净的 Ep 管中； 7 、加 2 倍上清体积 ( 约 1mL) 的无水乙醇, 振荡混匀，室 温放置 2min. 8 、 12000g 离心 10min ，弃上清液，再用 70 ％的乙醇 洗涤一次， 12000g 离心 1min ，离心管倒置于吸水纸上 扣干，然后在中空浓缩系统上干燥质粒； 9 、加入 40  L 含 20  g/mL RNase A 的灭菌蒸馏水或 TE 缓冲液溶解提取物，室温放置直到质粒完全溶解 ( 约 8min) ，存于－ 20 ℃或直接用于酶切。

质粒图谱 :

( 四 ) 提取质粒的酶切鉴定与琼脂糖凝胶电泳： 1 、在 0.5mL Ep 管中依次加入下列溶液于 0.5ml 离 心管中 提取质粒 DNA 3.0  L 10× buffer H 1.0  l EcoR I 2.0 U dd H2O 5.8  L 10  L 1U: 1 单位酶通常定义为，在建议缓冲液及温度下， 在 20  L 反应液中反应 1h ，使 1  g DNA 完全消化所需的酶量. 2 、 轻轻混匀, 4000g 离心 10 秒 ，置于 37 ℃水浴中 酶解 1.5h 。 3 、酶解完成后，加入 1.2  l 10× 上样缓冲液 ( 或 2  l 6× 上样缓冲液 ), 混匀. 4 、称取 1g 琼脂糖，置于三角瓶中，加入 100mL 0.5×TBE 或 1×TAE 缓冲液，瓶口倒扣一个小烧杯，将 该三角瓶置于微波炉加热直至琼脂糖溶解。

5 、将梳子放置在制胶槽上，在冷却至 60 ℃左右的 琼脂糖凝胶液加入一小滴 EB ，小心混匀，倒到制胶槽 上，直到在整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层，不 要产生气泡（厚度约为 3 ～ 4mm ）； 6 、 室温下静置 30min 左右，待凝固完全后，轻轻 拔出梳子。 7 、制好胶后将凝胶连同内槽放在含有 0.5×TBE 或 1×TAE 缓冲液的电泳槽中使用 ( 注意 : 电泳槽中的缓冲 液应与配胶用的缓冲液成分、浓度一致 ) 。 8 、用微量加样器将样品分别加入胶板的样品孔内 加完样后的凝胶板即可通电进行电泳（ 80 ～ 100V 的电 压下电泳，一般情况下，电压 / 电极间距离应小于 5V/cm ），当溴酚兰移动到距离胶板下沿约 1cm 处停止 电泳。

9 、在紫外灯 (310nm 波长 ) 下观察染色后的凝胶。 DNA 存在处显示出红色的荧光条带 ( 在紫外灯下观察时， 应戴上防护眼镜或有机玻璃防护面罩，避免眼睛遭受 强紫外光损伤，拍照电泳图谱时，可采用凝胶成象系 统 ) 。

五. 实验结果报告： 1 、转化效率的计算 ： 转化子总数＝菌落数 × （转化反应原液总体积 / 涂 板菌液体积） 转化效率（每微克质粒 DNA 的转化子数） ＝转化 子总数（个转化子） / 加入质粒 DNA 的量（ μg ） 2 、质粒提取与酶切鉴定结果，贴上打印实验照片 并标明照片上各 DNA 条带的含义。

六、思考题： 1 、何谓感受态细胞？制备感受态细胞的理论依据 是什么？ 1 、何谓感受态细胞？制备感受态细胞的理论依据 是什么？ 2 、为什么通常使用 R - M - 菌作为基因工程受体菌？ 2 、为什么通常使用 R - M - 菌作为基因工程受体菌？ 3 、简述 CaCl 2 制备细菌感受态细胞及其转化的基本原 理。 3 、简述 CaCl 2 制备细菌感受态细胞及其转化的基本原 理。 4 、根据 DNA 限制酶的识别切割特性， 催化条件及是 否具有修饰酶活性可分为几种类型？其中 II 类限制性内 切酶有何特性？ 4 、根据 DNA 限制酶的识别切割特性， 催化条件及是 否具有修饰酶活性可分为几种类型？其中 II 类限制性内 切酶有何特性？ 5 、在用碱裂解法小量制备质粒过程中 I 液、 II 液与 III 液 的作用机理是什么？ 5 、在用碱裂解法小量制备质粒过程中 I 液、 II 液与 III 液 的作用机理是什么？ 6 、简述碱裂解法小量制备质粒的原理。 6 、简述碱裂解法小量制备质粒的原理。

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