Η παρουσίαση φορτώνεται. Παρακαλείστε να περιμένετε

Η παρουσίαση φορτώνεται. Παρακαλείστε να περιμένετε

ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΙΑΣ Μαρία Σάτρα Δρ. Βιολόγος Απομόνωση DNA-PCR.

Παρόμοιες παρουσιάσεις


Παρουσίαση με θέμα: "ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΙΑΣ Μαρία Σάτρα Δρ. Βιολόγος Απομόνωση DNA-PCR."— Μεταγράφημα παρουσίασης:

1

2 ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΙΑΣ Μαρία Σάτρα Δρ. Βιολόγος Απομόνωση DNA-PCR

3 Oι μέθοδοι απομόνωσης DNA στηρίζονται στην σταθερότητά του σε επίδραση χημικών: Δραστικές χημικές ομάδες (αζωτούχες βάσεις) βρίσκονται στο εσωτερικό της διπλής έλικας Όλη η δομή προφυλάσσεται από τις φωσφορικές ομάδες και τα σάκχαρα στο εξωτερικό => DNA = χημικά αδρανές

4 Σημαντικότεροι παράμετροι για την απομόνωση DNA 1.Το είδος των κυττάρων ή του ιστού από τα οποία θα απομονώσουμε DNA 2.Οι χρονικοί περιορισμοί/ο αριθμός δειγμάτων 3.Η χρήση του DNA μετά την απομόνωσή του (π.χ. καθαρότητα κτλ)

5 ΤΕΧΝΙΚΗ ΑΠΟΜΟΝΩΣΗΣ DNA ΜΕ ΤΟ QIAamp Mini Kit Η απομόνωση βασίζεται στη χρησιμοποίηση στηλών που φέρουν μεμβράνες από πηκτή σιλικόνης η οποία δεσμεύει εκλεκτικά νουκλεϊκά οξέα, ενώ είναι διαπερατή από πρωτεΐνες και δισθενή κατιόντα που μπορεί να αναστείλουν την DNA πολυμεράση κατά την αντίδραση PCR

6 ΤΕΧΝΙΚΗ ΑΠΟΜΟΝΩΣΗΣ DNA ΜΕ ΤΟ QIAamp Mini Kit Το kit περιέχει: 1.Τις κατάλληλες στήλες, 2.Πρωτεϊνάση Κ, 3.το διάλυμα AL (διάλυμα λύσης), 4.Τα διαλύματα AW1 και AW2 (διαλύματα για τις εκπλύσεις απαιτείται αρχικά η προσθήκη αιθανόλης) και 5.Το διάλυμα ΑΕ (διάλυμα έκλουσης και επαναδιάλυσης του DNA).

7 ΤΕΧΝΙΚΗ ΑΠΟΜΟΝΩΣΗΣ DNA ΜΕ ΤΟ QIAamp Mini Kit 200 μl δείγματος ( κύτταρα)

8 ΤΕΧΝΙΚΗ ΑΠΟΜΟΝΩΣΗΣ DNA ΜΕ ΤΟ QIAamp Mini Kit Σε 200 μl δείγματος ( κύτταρα) προσθέτουμε 20 μl πρωτεϊνάση Κ Προσθήκη 200 μl buffer AL, vortex για 15 sec Τοποθέτηση στους 55 ο C για 10 min

9 ΤΕΧΝΙΚΗ ΑΠΟΜΟΝΩΣΗΣ DNA ΜΕ ΤΟ QIAamp Mini Kit Προσθήκη 200μl αιθανόλης (96-100%) Vortex

10 ΤΕΧΝΙΚΗ ΑΠΟΜΟΝΩΣΗΣ DNA ΜΕ ΤΟ QIAamp Mini Kit Μεταφορά σε στήλες

11 ΤΕΧΝΙΚΗ ΑΠΟΜΟΝΩΣΗΣ DNA ΜΕ ΤΟ QIAamp Mini Kit Φυγοκέντρηση στις rpm για 1 min

12 ΤΕΧΝΙΚΗ ΑΠΟΜΟΝΩΣΗΣ DNA ΜΕ ΤΟ QIAamp Mini Kit Μεταφορά της στήλης σε καθαρό σωληνάριο Προσθήκη 500μl AW1 Φυγοκέντρηση στις rpm για 1 min

13 ΤΕΧΝΙΚΗ ΑΠΟΜΟΝΩΣΗΣ DNA ΜΕ ΤΟ QIAamp Mini Kit Μεταφορά της στήλης σε καθαρό σωληνάριο Προσθήκη 500μl AW2, φυγοκέντρηση στις rpm για 3min

14 ΤΕΧΝΙΚΗ ΑΠΟΜΟΝΩΣΗΣ DNA ΜΕ ΤΟ QIAamp Mini Kit Μεταφορά της στήλης σε καθαρό σωληνάριο Προσθήκη 50μl EB

15 ΤΕΧΝΙΚΗ ΑΠΟΜΟΝΩΣΗΣ DNA ΜΕ ΤΟ QIAamp Mini Kit Φυγοκέντρηση στις rpm για 3min DNA

16 PCR Polymerase Chain Reaction….

17 5’-GGGCCATATGGTCCAGTCACCCAAGGTCAGTCCAACGGACTTAGTATTGCACCGAC-3’ 3’-CCCGGTATACCAGGTCAGTGGGTTCCAGTCAGGTTGCCTGAATCATAACGTGGCTG-5’ DNA 5’-GGGCCATATGGTCCAGTCA-3’ 5’-GTCGGTGCAATACTAAGTC-3’ primer 1 primer 2 5’-GTCGGTGCAATACTAAGTC-3’ 5’-GGGCCATATGGTCCAGTCA-3’ Πώς ακριβώς δουλεύει?

18 5’-GGGCCATATGGTCCAGTCACCCAAGGTCAGTCCAACGGACTTAGTATTGCACCGAC-3’ 3’-CCCGGTATACCAGGTCAGTGGGTTCCAGTCAGGTTGCCTGAATCATAACGTGGCTG-5’ 5’-GGGCCATATGGTCCAGTCA-3’ 5’-GTCGGTGCAATACTAAGTC-3’ 5’-GGGCCATATGGTCCAGTCA-3’ Αποδιάταξη: 95 ºC cycle 1

19 5’-GGGCCATATGGTCCAGTCACCCAAGGTCAGTCCAACGGACTTAGTATTGCACCGAC-3’ 3’-CCCGGTATACCAGGTCAGTGGGTTCCAGTCAGGTTGCCTGAATCATAACGTGGCTG-5’ 5’-GGGCCATATGGTCCAGTCA-3’ 5’-GTCGGTGCAATACTAAGTC-3’ 5’-GGGCCATATGGTCCAGTCA-3’ Υβριδοποίηση: 55 ºC cycle 1

20 5’-GGGCCATATGGTCCAGTCACCCAAGGTCAGTCCAACGGACTTAGTATTGCACCGAC-3’ 3’-CCCGGTATACCAGGTCAGTGGGTTCCAGTCAGGTTGCCTGAATCATAACGTGGCTG-5’ 5’-GGGCCATATGGTCCAGTCACCCAAGGTCAGTCCAACGGACTTAGTATTGCACCGAC-3’ 5’-GGGCCATATGGTCCAGTCA-3’ 5’-GTCGGTGCAATACTAAGTCCGTTGGACTGACCTTGGGTGACTGGACCATATGGCCC-3’ 5’-GTCGGTGCAATACTAAGTC-3’ 5’-GGGCCATATGGTCCAGTCA-3’ Επιμήκυνση: 72 ºC cycle 1

21 5’-GGGCCATATGGTCCAGTCACCCAAGGTCAGTCCAACGGACTTAGTATTGCACCGAC-3’ 3’-CCCGGTATACCAGGTCAGTGGGTTCCAGTCAGGTTGCCTGAATCATAACGTGGCTG-5’ 5’-GGGCCATATGGTCCAGTCACCCAAGGTCAGTCCAACGGACTTAGTATTGCACCGAC-3’ 5’-GGGCCATATGGTCCAGTCA-3’ 5’-GTCGGTGCAATACTAAGTCCGTTGGACTGACCTTGGGTGACTGGACCATATGGCCC-3’ 5’-GTCGGTGCAATACTAAGTC-3’ 5’-GGGCCATATGGTCCAGTCA-3’ Αποδιάταξη: 95 ºC cycle 2

22 5’-GGGCCATATGGTCCAGTCACCCAAGGTCAGTCCAACGGACTTAGTATTGCACCGAC-3’ 5’-GGGCCATATGGTCCAGTCA-3’ 5’-GTCGGTGCAATACTAAGTCCGTTGGACTGACCTTGGGTGACTGGACCATATGGCCC-3’ 5’-GTCGGTGCAATACTAAGTC-3’ 5’-GGGCCATATGGTCCAGTCA-3’ 3’-CCCGGTATACCAGGTCAGTGGGTTCCAGTCAGGTTGCCTGAATCATAACGTGGCTG-5’ 5’-GGGCCATATGGTCCAGTCA-3’ Υβριδοποίηση: 55 ºC cycle 2

23 5’-GGGCCATATGGTCCAGTCACCCAAGGTCAGTCCAACGGACTTAGTATTGCACCGAC-3’ 3’-CCCGGTATACCAGGTCAGTGGGTTCCAGTCAGGTTGCCTGAATCATAACGTGGCTG-5’ 5’-GGGCCATATGGTCCAGTCACCCAAGGTCAGTCCAACGGACTTAGTATTGCACCGAC-3’ 5’-GGGCCATATGGTCCAGTCA-3’ 5’-GTCGGTGCAATACTAAGTCCGTTGGACTGACCTTGGGTGACTGGACCATATGGCCC-3’ 5’-GTCGGTGCAATACTAAGTC-3’ 5’-GGGCCATATGGTCCAGTCA-3’ Επιμήκυνση: 72 ºC cycle 2

24 5’-GGGCCATATGGTCCAGTCACCCAAGGTCAGTCCAACGGACTTAGTATTGCACCGAC-3’ 3’-CCCGGTATACCAGGTCAGTGGGTTCCAGTCAGGTTGCCTGAATCATAACGTGGCTG-5’ 5’-GGGCCATATGGTCCAGTCACCCAAGGTCAGTCCAACGGACTTAGTATTGCACCGAC-3’ 5’-GGGCCATATGGTCCAGTCA-3’ 5’-GTCGGTGCAATACTAAGTCCGTTGGACTGACCTTGGGTGACTGGACCATATGGCCC-3’ 5’-GTCGGTGCAATACTAAGTC-3’ 5’-GGGCCATATGGTCCAGTCA-3’ Αποδιάταξη: 95 ºC cycle 3

25 5’-GGGCCATATGGTCCAGTCACCCAAGGTCAGTCCAACGGACTTAGTATTGCACCGAC-3’ 3’-CCCGGTATACCAGGTCAGTGGGTTCCAGTCAGGTTGCCTGAATCATAACGTGGCTG-5’ 5’-GGGCCATATGGTCCAGTCACCCAAGGTCAGTCCAACGGACTTAGTATTGCACCGAC-3’ 5’-GGGCCATATGGTCCAGTCA-3’ 5’-GTCGGTGCAATACTAAGTCCGTTGGACTGACCTTGGGTGACTGGACCATATGGCCC-3’ 5’-GTCGGTGCAATACTAAGTC-3’ 5’-GGGCCATATGGTCCAGTCA-3’ 5’-GTCGGTGCAATACTAAGTC-3’ Υβριδοποίηση: 55 ºC cycle 3

26 5’-GGGCCATATGGTCCAGTCACCCAAGGTCAGTCCAACGGACTTAGTATTGCACCGAC-3’ 3’-CCCGGTATACCAGGTCAGTGGGTTCCAGTCAGGTTGCCTGAATCATAACGTGGCTG-5’ 5’-GGGCCATATGGTCCAGTCACCCAAGGTCAGTCCAACGGACTTAGTATTGCACCGAC-3’ 5’-GTCGGTGCAATACTAAGTCCGTTGGACTGACCTTGGGTGACTGGACCATATGGCCC-3’ 5’-GGGCCATATGGTCCAGTCACCCAAGGTCAGTCCAACGGACTTAGTATTGCACCGAC-3’ 5’-GTCGGTGCAATACTAAGTCCGTTGGACTGACCTTGGGTGACTGGACCATATGGCCC-3’ Επιμήκυνση: 72 ºC cycle 3

27 In the late 1960's, Thermus aquaticus was first discovered in several springs in the Great Fountain area of the Lower Geyser Basin of Yellowstone National Park. It has since been found in thermal habitats throughout the world. Its temperature range is about degrees C ( degrees F), and its optimum is around 70 degrees C (158 degrees F). Purification of DNA polymerase from Thermus aquaticus was key to the development of PCR Photos © 1994 Yellowstone Association for Natural Science, History & Education, Inc. Yellowstone National Park, Wyoming The hot spring in which Taq was first discovered

28 The bacterium is Thermus aquaticus:

29 Η DNA πολυμεράση του Thermus aquaticus ονομάζεται Taq για συντομία Δεν κατστρέφεται στους 94ºC Δρα ιδανικά στους 72ºC

30 1 ATTTAATTAT GGCCGATTCG TGCGCGGAAA ATGCCGCCAA AGGGACGGAA 51 AATGAGCGGC CGAAGAAGTG GAGGCCAGCG CCGACACCGT CCCACAGGTG 101 GAGGAGGGCG TAGAGGAGTA TTTGAAGCGT AAGAACATGG TCCTCCTCGA 151 CTACGAAAAG CAAATGTTTC TCGATTTGGT CGAGGCCGAT GGTCTGCTGG 201 TTTGCGCCAA GGGCCTGAGC TACGACCGCG TTGTAATCAG CATCCTCAAG 251 GCCTACAGCG ATTCCGGCAA TCTTGTGCTT GTGATCAACA GTTCTGACTG 301 GGAGGAGCAG TATTACAAGT CCAAAATCGA ACCCAAATAT GTCCACGAAG 351 GTGCCAGCAC GGCCACCGAA AGAGAGCGCG TTTATCTGGA AGGCGGGCTG 401 CAGTTCATTA GCACGCGCAT CCTGGTGGTG GATCTGCTCA AGCAGCGAAT The DNA sequence of the coding strand for a gene is shown below. The number on each line corresponds to the position of the first nucleotide on that line. PCR is performed using the primers 5'-GCCCGCCTTCCAGATAAAC-3' and 5'-GCGGAAAATGCCGCCAAA -3'. What is the expected size of the product?

31 1 GCGGAAA ATGCCGCCAA AGGGACGGAA 51 AATGAGCGGC CGAAGAAGTG GAGGCCAGCG CCGACACCGT CCCACAGGTG 101 GAGGAGGGCG TAGAGGAGTA TTTGAAGCGT AAGAACATGG TCCTCCTCGA 151 CTACGAAAAG CAAATGTTTC TCGATTTGGT CGAGGCCGAT GGTCTGCTGG 201 TTTGCGCCAA GGGCCTGAGC TACGACCGCG TTGTAATCAG CATCCTCAAG 251 GCCTACAGCG ATTCCGGCAA TCTTGTGCTT GTGATCAACA GTTCTGACTG 301 GGAGGAGCAG TATTACAAGT CCAAAATCGA ACCCAAATAT GTCCACGAAG 351 GTGCCAGCAC GGCCACCGAA AGAGAGCGCG TTTATCTGGA AGGCGGGC The DNA sequence of the coding strand for a gene is shown below. The number on each line corresponds to the position of the first nucleotide on that line. PCR is performed using the primers 5'-GCCCGCCTTCCAGATAAAC-3' and 5'-GCGGAAAATGCCGCCAAA -3'. What is the expected size of the product? PCR product = =

32 1 ATTTAATTAT GGCCGATTCG TGCGCGGAAA ATGCCGCCAA AGGGACGGAA 51 AATGAGCGGC CGAAGAAGTG GAGGCCAGCG CCGACACCGT CCCACAGGTG 101 GAGGAGGGCG TAGAGGAGTA TTTGAAGCGT AAGAACATGG TCCTCCTCGA 151 CTACGAAAAG CAAATGTTTC TCGATTTGGT CGAGGCCGAT GGTCTGCTGG 201 TTTGCGCCAA GGGCCTGAGC TACGACCGCG TTGTAATCAG CATCCTCAAG 251 GCCTACAGCG ATTCCGGCAA TCTTGTGCTT GTGATCAACA GTTCTGACTG 301 GGAGGAGCAG TATTACAAGT CCAAAATCGA ACCCAAATAT GTCCACGAAG 351 GTGCCAGCAC GGCCACCGAA AGAGAGCGCG TTTATCTGGA AGGCGGGCTG 401 CAGTTCATTA GCACGCGCAT CCTGGTGGTG GATCTGCTCA AGCAGCGAAT The DNA sequence of the coding strand for a gene is shown below. The number on each line corresponds to the position of the first nucleotide on that line. PCR is performed using the primers 5'-GTTTATCTGGAAGGCGGGC-3' and 5'-GCGGAAAATGCCGCCAAA -3'. What is the expected size of the product? No PCR product!

33 Polymerase Chain Reaction (PCR)

34 After 1 cycle copies double After 2 cycles copied doubled and new strand is unit length (goes only from primer to primer) Polymerase Chain Reaction

35 After 3 cycles copies are increased 8-fold and new copies are ds and unit length Odd length copies increase arithmetically Unit length copies increase in number geometrically

36 Polymerase Chain Reaction By completion of cycles nearly all copies are ds DNA and unit length products

37 GAPDH: Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (abbreviated as GAPDH) is an enzyme of ~37kDa that catalyzes the sixth step of glycolysis and thus serves to break down glucose for energy and carbon molecules.enzymeglycolysisglucose In addition to this long established metabolic function, GAPDH has recently been implicated in several non- metabolic processes, including transcription activation, initiation of apoptosis, [1] ER to Golgi vesicle shuttling, and fast axonal, or axoplasmic transport.transcriptionapoptosis [1]ER to Golgi vesicle shuttlingaxoplasmic transport

38 Η αγαρόζη, που προέρχεται από φύκη, είναι ένα ευθύγραμμο πολυμερές του οποίου η βασική δομή είναι D-γαλακτόζη-3,6-ανυδρο L-γαλακτόζη. Οι εμπορικά διαθέσιμοι τύποι αγαρόζης δεν είναι πλήρως καθαροί και περιέχουν άλλους πολυσακχαρίτες, άλατα και πρωτεϊνες. Τα πηκτώματα αγαρόζης παρασκευάζονται λιώνοντας την αγαρόζη στο κατάλληλο ρυθμιστικό διάλυμα μέχρις ότου το διάλυμα γίνει εντελώς διαυγές. Το διάλυμα τοποθετείται σε κατάλληλη συσκευή όπου και πήζει. Όταν εφαρμοστεί το ηλεκτρικό πεδίο κατά μήκος του πηκτώματος, το DNA, αρνητικά φορτισμένο σε ουδέτερο pH, κατευθύνεται προς την άνοδο. Κατασκευή πηκτώματος αγαρόζης:

39 Πρακτικά

40 Ηλεκτροφόρηση

41 Ο ρυθμός κινητικότητας του DNA στα πηκτώματα αγαρόζης εξαρτάται κυρίως από 4 παραμέτρους: Το μέγεθος του DNA. Τη συγκέντρωση της αγαρόζης. Τη στερεοδιάταξη του DNA. Την ένταση του ρεύματος.

42 ...φόρτωμα πηκτής.....

43 Χαρακτηρισμός εκχυλισμένου DNA Ποιοτικά Ηλεκτροφόρηση σε gel αγαρόζης του DNA που απομονώσαμε

44 Χαρακτηρισμός εκχυλισμένου RNA Ποιοτικά Ηλεκτροφόρηση σε gel αγαρόζης του RNA που απομονώσαμε

45 Χαρακτηρισμός εκχυλισμένου DNA και RNA Ποσοτικά Μέτρηση της απορρόφησης στα 260 nm και στα 280 nm


Κατέβασμα ppt "ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΙΑΣ Μαρία Σάτρα Δρ. Βιολόγος Απομόνωση DNA-PCR."

Παρόμοιες παρουσιάσεις


Διαφημίσεις Google