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DNA 的提取方法简介 为了研究 DNA 分子在生命代谢中的作用,常常 需要从不同的生物材料中提取 DNA. 由于 DNA 分子在生物体内的分布及含量不同,要选择适 当的材料提取 DNA 。 动植物中,小牛胸腺 ۰ 动物肝脏 ۰ 鱼类精子,植 物种子的胚中都含有丰富的 DNA 。 微生物中,谷氨酸菌体含.

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Παρουσίαση με θέμα: "DNA 的提取方法简介 为了研究 DNA 分子在生命代谢中的作用,常常 需要从不同的生物材料中提取 DNA. 由于 DNA 分子在生物体内的分布及含量不同,要选择适 当的材料提取 DNA 。 动植物中,小牛胸腺 ۰ 动物肝脏 ۰ 鱼类精子,植 物种子的胚中都含有丰富的 DNA 。 微生物中,谷氨酸菌体含."— Μεταγράφημα παρουσίασης:

1 DNA 的提取方法简介 为了研究 DNA 分子在生命代谢中的作用,常常 需要从不同的生物材料中提取 DNA. 由于 DNA 分子在生物体内的分布及含量不同,要选择适 当的材料提取 DNA 。 动植物中,小牛胸腺 ۰ 动物肝脏 ۰ 鱼类精子,植 物种子的胚中都含有丰富的 DNA 。 微生物中,谷氨酸菌体含 7%~10% ,面包酵母 含 4% ,啤酒酵母含 6% ,大肠肝菌含 9%~10% 。

2 从各种材料中提取 DNA 方法不同,分离提取的 难易程度也不同。 对于低等生物。如从病毒中提取 DNA 比较容 易,多数病毒 DNA 分子量较小,提取时易保 持其结构完整性。 从细菌及高等动植物中提取 DNA 难度大一些。 细菌 DNA 分子量较大,一般达 2×10 道尔顿。 因此易被机械张力剪断。细菌 DNA ,除核 DNA 外,还有质粒 DNA 等。

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5 1 、核酸的理化性质 RNA 和核苷酸的纯品都呈白色粉末或结晶, DNA 则 为白色类似石棉样的纤维状物。除肌苷酸、鸟苷酸具有 鲜味外,核酸和核苷酸大都呈酸味。 DNA 、 RNA 和核苷酸都是极性化合物,一般都溶于 水,不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂,它们的钠盐比游离 酸易溶于水, RNA 钠盐在水中溶解度可达 40g/L 。 DNA 在水中为 10g/L ,呈黏性胶体溶液。在酸性溶液中, DNA 、 RNA 易水解,在中性或弱碱性溶液中较稳定。

6 天然状态的 DNA 是以脱氧核糖核蛋白 (DNP) 形式存 在于细胞核中。要从细胞中提取 DNA 时,先把 DNP 抽提出来,再把 P 除去,再除去细胞中的糖, RNA 及无机离子等,从中分离 DNA 。 DNP 和 RNP 在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响而 不同。 DNP 在低浓度盐溶液中,几乎不溶解,如在 0.14 mol/L 的氯化钠溶解度最低,仅为在水中溶解度 的 1% ,随着盐浓度的增加溶解度也增加,至 1mol/L 氯化钠中的溶解度很大,比纯水高 2 倍。 RNP 在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响较小,在 0.14mol/L 氯化钠中溶解度较大。因此,在提取时, 常用此法分离这两种核蛋白。

7 细菌有坚硬的细胞壁,首先要破碎经胞。方 法有三种: ①机械方法:超声波处理法、研磨法、 匀浆法; ②化学试剂法:用 SDS 处理细胞; ③酶解法:加入溶菌酶或蜗牛酶,都可 使细胞壁破碎。 2. 细胞的破碎

8 由于高等动物 DNA 主要存在于细胞核与线粒体中, 所以提取时有两个困难(高等植物与此类似): ①破碎细胞难;从处死动物 ٠ 分离组织器宫到 破碎细胞费时长。在此时期间 DNA 可能会被 DN ase 降解,而动物组织:特别是肌肉组织很难破碎, 即使是较易破碎的肝 ٠ 肾等组织也往往使用组织 匀浆器,易造成 DNA 断裂。 ②分子量大,一般比细菌的大 2—3 个数量级, 比病毒的大 4—5 个数量。对不同生物材料,要根 据具体情况选择适当的分离提取方法。

9 3.DNA 提取的几种方法 (1). 浓盐法 利用 RNP 和 DNP 在电解溶液中溶解度不同,将二者分离,常 用的方法是用 1M 氯 纳提取化钠抽提, 得到的 DNP 粘液与含有少 量辛醇的 氯仿一起摇荡, 使乳化, 再离心除去蛋白质, 此时蛋白质 凝胶停留在水相及氯仿相中间,而 DNA 位于上层水相中, 用 2 倍 体积 95% 乙醇可将 DNA 钠盐沉淀出来. 也可用 0.15 MNaCL 液反复洗涤细胞破碎液除去 RNP, 再以 1MNaCL 提取脱氧核糖蛋白, 再按氯仿 --- 异醇法除去蛋白. 两种方法比较, 后种方法使核酸降解可能少一些. 以稀盐酸溶液提取 DNA 时, 加入适量去污剂, 如 SDS 可有助于 蛋白质与 DNA 的分离。在提取过程中为抑制组织中的 DNase 对 DNA 的降解作用, 在氯化钠溶液中加入柠檬酸钠作为金属离子 的烙合剂. 通常用.15MNaCL,0.015M 柠檬钠, 并称 SSC 溶液, 提取 DNA.

10 ( 2 ). 阴离子去污剂法 : 用 SDS 或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变性, 可以直 接从生物材料中提取 DNA. 由于细胞中 DNA 与蛋白质之 间常借静电引力或配位键结合, 因为阴离子去污剂能够 破坏这种价键, 所以常用阴离子去污剂提取 DNA. ( 3 ). 苯酚抽提法 : 苯酚作为蛋白变性剂, 同时抑制了 DNase 的降解作用. 用苯酚处理匀浆液时, 由于蛋白与 DNA 联结键已断, 蛋白 分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分 子溶于酚相,而 DNA 溶于水相。离心分层后取出水层, 多次重复操作,再合并含 DNA 的水相,利用核酸不溶 于醇的性质,用乙醇沉淀 DNA 。此时 DNA 是十分粘稠 的物质,可用玻璃漫漫绕成一团,取出。此法的特点是 使提取的 DNA 保持天然状态.

11 ( 4 ). 水抽提法 : 利用核酸溶解于水的性质, 将组织细胞破碎后, 用低 盐溶液除去 RNA ,然后将沉淀溶于水中,使 DNA 充 分溶解于水中, 离心后收集上清液. 在上清中加入固体 氯化钠调节至 2.6M. 加入 2 倍体积 95% 乙醇, 立即用搅拌 法搅出. 然后分别用 66% ٠ 80% 和 95% 乙醇以及丙铜洗 涤, 最后在空气中干燥, 既得 DNA 样品. 此法提取的 DNA 中蛋白质含量较高, 故一般不用. 为除蛋白可将此法加 以改良, 在提取过程中加入 SDS.

12 二. 从猪脾中提取 DNA

13 1. 操作步骤 : 取鲜猪脾, 去脂、血, 称取 10g, 用预冷的 1×SSC 溶液洗 2 次,剪碎。 按睥: 1×SSC=1; 5W/V 加入 50ml 预冷的 1×SSC ,用高速组织 捣碎机破碎 8 次, 每次 5 秒, 中间间隔 30 秒。 将匀浆液放在烧杯中, 于冰盐浴中冷却 30 分钟。 4000 转 / 分钟 离心 10 分钟。充掉上清。沉淀物中再加 2 倍体积的 1×SSC 搅匀,离心, 弃上清,重复 2 次。 将所得沉淀悬于 5 倍体积的 PH8.0 、 0.15MNaCL—0.1Na 2 MEDTA 溶液中。边搅拌边漫漫滴加 5%SDS 最终浓度达 1% 为止。然后加入 固体氯化钠使其最终浓度达 1mol/L ,继续搅 60 分钟,以确保氯化钠 全溶。所得混合液倒入磨口塞的锥形瓶中,加入同体积氯仿 — 异戊 醇,激烈振荡 20 分钟, 4000r 离心 20 分钟,上层水相取出后倒入烧杯, 以同积氯仿 — 异戊醇重复去蛋白 2 次。 取出水相于烧杯中,逐渐加入 2 倍体积 95% 乙醇,玻棒搅动, DNA 纤维绕于璃玻棒上后挤干,用 70% 乙醇洗 DNA 纤维 2 次,用 95% 乙醇洗一次,再用乙醚洗一次,取出并挤干 。

14 2. 实验材料,仪器和试剂: ( 1 ) 实验材料:新鲜猪脾: ( 2 )仪器:量筒: 1×10 、 3×100 烧杯: 2×100 , 2×250 ;磨 口锥形瓶: 1×250 、 1×500 ;吸管: 1×1 、 1×10 ;滴管、玻棒、 离心机、电动搅拌器、台秤、剪刀、镊子。 ( 3 ) 试剂: ① 20×SSC : 175.2gNaCL , 88.2g 柠檬酸钠 2H 2 O , PH=7.0 加 水至 1000ml ; ② 1×SSC , 0.1×SSC 由①做相应的稀释得来; ③ NaCL-Na 2 EDTA 液: 8.77gNaCL , 3.72gNa 2 EDTA 溶于 800ml 蒸馏水中,用固体 NaOH 调 PH=8 后定容至 1000 ; ④ 5%SDS ( W/V ): 6gSDS 溶于 100ml45% 乙醇中; ⑤ 氯仿 - 异戊醇 =24 : 1 (体积比) ⑥ 其他 :95% 乙醇,盐冰. 数据 :DNA 重, 产率 : 待测液中测得的核酸 μg 数 DNA%= ×100 待测液中制品的 μg 数

15 二苯胺显色法测定 DNA 含量 强酸、加热条件下,可以使 DNA 中的嘌呤碱基与 脱氧核糖间的糖苷键断裂,而产生嘌呤碱基,脱氧 核糖与嘧啶核苷酸。其中 2 ˊ脱氧核糖在酸性环境中成 为 ω― 羟基 ―γ― 酮基戊醛,此物与二苯胺反应生成 蓝色化合物,在 595nm 处有最大吸收。 DNA 在 μg 范围内光密度与 DNA 浓度成正比。在反应液中 加入少量乙醛可提高灵敏度,而且其他化合物的干 扰也显著降低。当样品含少量 RNA 时不影响测定, 而蛋白质、多种糖及其衍生物芳香,羟基醛都能与 二苯胺形成各种有色物质,干扰测定。

16 1、二苯胺试剂:使用前称取 0.8g 二苯胺(需在 70% 乙醇试 剂中重结晶 2 次 ) ,溶于 180ml 冰乙酸中,再加入 8ml 过氯酸 ( 60% 以上),混匀待用,临用前加入 0.8ml 1.6% 乙醛溶液,所 配试剂应为无色。 每组需 56ml 共需 2800ml 2、 DNA 标准溶液:(须经定磷法确定其浓度)取标准 DNA 以 0.01N NAOH 配成 200 微克/毫升的标准液。 每组需 12ml 共需 600ml 3、 1.6% 乙醛:取 47% 乙醛 3.4ml ,加重蒸水定容至 100ml (放于冰箱中,一周之内可以使用)。 共需 70ml 4、 ( 测样品液:准确称取猪脾 DNA 或用紫外分光法中剩下 的 DNA 液配成 10 微克/毫升的溶液。 每组需 4ml 共需 200ml

17 操作方法: 1. DNA 标准曲线的制定: 取 10 支试管,分成 2 组,依次加入 0.4 、 0.8 、 1.2 、 1.6 和 2.0mlDNA 标准溶液。添加蒸馏水,使之都成为 2ml 。另 取 2 只试管,各加 2ml 蒸馏水作为对照。然后各加入 4ml 二 苯胺试剂,混匀。于 60 恒温水浴中保温 1h ,冷却后于 595nm 处进行比色测定。取两管平均值,以 DNA 浓度为横 坐标,光吸收值为纵坐标,绘制标准曲线。 2. 制品的测定: 取 2 支试管,各加 2ml 待测液(内含 DNA 应在标准曲 线的可范围之内)和 4ml 二苯胺试剂,摇匀。其于操作同 标准曲线的制作。 3. 根据测得的光吸收值,从标准曲线待测上查出相应 该光吸收值 DNA 的含量,计算出制品中的百分含量。

18 1. 为什么在低温下进行? 2. 分别加柠檬酸钠和 EDTA 的作用 ? 3. 加 SDS 的作用? 4. 加 NaCL 的作用,为什么要加到 1mol/L? 5. 加入异戊醇有什么作用?


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