食用油中转基因 植物成分定性 食品质量安全综合大实验. 一、实验原理  植物性食用油脂经过提取 DNA 后，根据榨油 用的转基因植物原料所插人的外源基因设计 引物，通过聚合酶链式反应 (PCR) 技术，特 异性扩增外源基因的 DNA 片断，根据 PCR 扩 增结果，判断该食用油脂中是否含有转基因.

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1 食用油中转基因 植物成分定性 食品质量安全综合大实验

2 一、实验原理  植物性食用油脂经过提取 DNA 后，根据榨油 用的转基因植物原料所插人的外源基因设计 引物，通过聚合酶链式反应 (PCR) 技术，特 异性扩增外源基因的 DNA 片断，根据 PCR 扩 增结果，判断该食用油脂中是否含有转基因 成分。

3 PCR 原理 Sample denaturatation Primer annealing Primer extension

4 二、实验仪器  PCR 热循环仪，超净工作台. ，消毒灭菌锅. ， 台式小型离心机，冷藏冷冻冰箱，旋涡震荡 器，恒温培养箱，恒温水浴，凝胶成像系统 微量移液器： 0. 5μL ， 2μL ， 10μL ， 20μL ， 100μL ， 200μL ， l000μL

5 PCR 仪 凝胶电泳槽

6 凝胶成像 系统

7 三、主要试剂.  1 、 RNase 酶溶液， CTAB 提取液， TE 缓冲液， 食用油（转基因），无水乙醇, 异丙醇，三氯 甲烷，双蒸水  2 、 DNA 分子量标准 PCRbuffer ， dATP,dTTP,dCTP,dGTP ， Taq 酶，引物  3 、电泳加样缓冲液，琼脂糖（电泳级），溴 化乙锭，核酸电泳缓冲液

8 四、检测步骤  1 、待检样品的制备 在 2 ml 离心管中加人 0.5 ml 食用油及 400 μL TE 缓冲液，颠倒混匀 5min ，室温下离心 13 000 r/min 3min. 去除上层油脂层 ; 再次向同 一支管中加人 0.5ml 食用油, 离心, 去除上层油 脂层, 反复二至五次. 取水相用于提取 DNA 。

9  2 、食用油脂中 DNA 的提取 CTAB 法 在制样获取约 400μL 的水相中, 加人 400μL CTAB 提取液和 2μL Rnase 酶，震荡后置于 65 ℃水浴 30 min; 加人等体积 24 ： 1 三氯甲烷 / 异戊醇，轻缓颠倒 数次后室温静置 5 min;13 000 r/min 室温下离心 5 min( 如果上清液比较浑浊, 重复此步骤 ); 转移并等分 上清液于二支 1.5 mL 离心管, 并加入 0.6 倍体积预冷 的异丙醇, 颠倒混匀后于一 4 ℃静置 lh-2h 沉淀 DNA;13000 r/min 室温离心 10min, 弃去上清液 ; 用 70% 乙醇洗涤沉淀二次, 干燥沉淀物 ; 每支离心管中 加人 30μL 至 50μL TE 缓冲液溶解沉淀,4 ℃保存备用

10 3 、 PCR 扩增反应 反应体系 （ 1 ） PCR Buffer2. 5μL ， Mgcl 25mmol/L2.5μL ， DNTP （ 2. 5 mmol/L ）各 2.0μL ，引物 20 pmol/μL 正 :0.25μL ； 0.25μL ， Taq 酶 5 U/μL 0.125μL ， DNA 模板 15ng/μL 5.0μL ， DdH2O 补足至反应总 体积为 25μL （ 2 ）反应参数 变性 95 度,5 min—— 扩增 95 度,30 s——60 度,30 s——72 度,30 s 循环数 35 延伸 72 度,3 min

11 4 、 PCR 扩增产物的检测  制备 2% 的琼脂糖凝胶, 按比例混匀电泳上 样缓冲液和 PCR 扩增产物, 然后将混有上样缓 冲液的 PCR 扩增产物加人样品孔中, 并用 DNA Marker 作分子量标记, 进行电泳分析. 电泳结束 后, 在凝胶成像仪的紫外透射光下观察是否扩 增出 162bp 的特异性 DNA 电泳带。