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SRY 基因的检测 目的要求 掌握 PCR 反应的基本原理 掌握性别决定的分子机制 掌握用 PCR 扩增检测性别的方法 掌握用 PCR 扩增检测性别方法的应用.

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Παρουσίαση με θέμα: "SRY 基因的检测 目的要求 掌握 PCR 反应的基本原理 掌握性别决定的分子机制 掌握用 PCR 扩增检测性别的方法 掌握用 PCR 扩增检测性别方法的应用."— Μεταγράφημα παρουσίασης:

1 SRY 基因的检测 目的要求 掌握 PCR 反应的基本原理 掌握性别决定的分子机制 掌握用 PCR 扩增检测性别的方法 掌握用 PCR 扩增检测性别方法的应用

2 原理 1 聚合酶链反应( polymerase chain reaction , PCR )的基本原理是,通 过热变性使目的 DNA (模板 DNA )双 链解开;通过退火将引物复性结合到 它们的互补位置;通过 DNA 聚合酶延 长引物,反复循环体外扩增出大量一 对引物之间的 DNA 片段。

3 聚 合 酶 链 反 应 Polymerase Chain Reaction ( PCR ) 一种可以将目的微量的 DNA 片断扩增 100 万倍以上的技术

4 指定的基因片段 PCR 可以把 指定的基因片段 数量放大 百万倍 染色体 Mullis (1993)

5 PCR 基本工作原理 以拟扩增的 DNA 分子为模板,以一 对分别与模板 3 ’ 和 5 ’ 端相互补的寡核 苷酸片段为引物,在 DNA 聚合酶的 作用下,按照半保留复制的机制延 模板链延伸直至完成新的 DNA 合成。 重复这一过程,可使目的 DNA 片段 得以扩增。

6 PCR 体系基本组成成分 含 Mg 2+ 的缓冲液 dNTPs 耐热 DNA 聚合酶 Tag DNA 聚合酶 特异性引物 一对分别与待扩增 DNA 序列两端互 补的寡核苷酸片段。 模板 DNA

7 PCR 基本反应步骤 变性 95˚C 延伸 72 ˚ C 退火 Tm-5 ˚ C 循环 次 使模板 DNA 完全变性成单链。 同时引物自身和引物之间存在 的局部双链得以消除 使引物和模板 DNA 退火结合 此温度下 DNA 聚合酶以 dNTP 为底物催化 DNA 链的延长 三个步骤为一个循环, 每次循环产物作为下一 轮模板进入下一轮循环

8 第一轮循环 5/5/ 3/3/ 3/3/ 5/5/ 5/ 引物 A 引物 B 变性( 95 ℃) ℃ 退火( 60 ℃) 延伸( 72 ℃) DNA-Pol DNA-Pol 温度

9 第二轮循环 5/ 5/5/ 3/3/ 3/3/ 5/5/ 引物 A 引物 B ℃ 变性( 95 ℃) 退火( 60 ℃) 延伸( 72 ℃) 5/ 温度 DNA-Pol

10 第三次循环 5/5/ 5/5/ 5/5/ 5/5/ 5/5/ 5/5/ 5/5/ ℃ 5/5/ 变性( 95 ℃) 退火( 60 ℃) 延伸( 72 ℃) 温度 DNA-Pol

11 基因组 DNA DNA 样品 第一次循环 第二次循环 第三次循环 第四次循环 待扩增序列 引物 A 引物 B 3/3/ 5/5/ 3/3/ 5/5/ 5/5/ 3/3/ 5/5/ 3/3/

12 PCR 的主要用途 PCR 的 用途 基因突变 分析 基因的 体外突变 目的基因 的克隆 DNA 序列测定 DNA 和 RNA 的微量分析 1 、与反转录结合, 直接从组织细胞中 的 mRNA 获得目的 基因; 2 、利用特异性引 物以 cDNA 或基因 组 DNA 为模板获得 目的基因片段; 3 、利用简并引物 从 cDNA 文库或基 因组文库中获得具 有一定序列相似性 的基因片段; 4 、利用随机引物 从 cDNA 文库中克 隆基因。 利用 PCR 技术可以随 意设计引物在体外对 目的 DNA 的基因片段 进行嵌和、缺失、点 突变等改造。 PCR 技术高度敏感,对 DNA 的含量要求很低。理 论上只要存在一分子的模 板就可以获得目的片段。 RNA 需要反转录。 利用 PCR 结合其它技 术,可以提高基因突 变检测的敏感性。

13 原理 2 人类个体的表型性别是由 Y 染色体决定 的, 具体地说是由 Y 染色体上编码睾丸发 育的睾丸决定因子 (testis determining factor,TDF) 基因所决定, TDF 基因的存 在决定着睾丸的发育,即决定个体发育 为男性。研究表明 TDF 基因位于 Y 染色体 短臂与拟常染色体相接的 35kb 区域,该 区域又称为 Y 染色体性别决定区( sex determining region of the Y , SRY )。 。

14 3 在 SRY 基因区域设计特异的引物,如果 能够利用 PCR 技术体外扩增出 SRY 基因片 段,即可判断为男性,否则为女性。本实 验在 SRY 基因区域内设计了一对引物,利 用引物 Y 1.5 / Y 1.6 扩增出一 239bp 的片段。 4 利用 PCR 技术扩增 SRY 基因片段检测性 别具有广泛的实际应用价值,如结合细胞 遗传学的核型分析,通过确认 SRY 所在区 域的缺失或易位,诊断 46 , XY 女性或 46 , XX 男性性反转综合征的患者;通过检测胎 儿的性别,预防甲型血友病、 G6PD 缺乏 症等 X 连锁隐性遗传病患儿的出生;

15 5 通过骨髓移植后 Y 染色体特异的 SRY 基因片段的 DNA 分析是由阳性转为阴 性或相反,来判断异性别的骨髓移植程 度;多年尸块的 DNA 常有降解,而 PCR 只分析 DNA 的一小部分,不受降 解的影响,因此本实验技术常应用于法 医学上尸块或血斑的性别确定;此外, 本实验还可用于需要快速、准确、同时 需检查大量标本的运动员体检。

16 一、 由微量外周血标本制备模板 DNA 试剂与材料: 1 、 细胞裂解缓冲液 ( SDS ;蛋白酶 K ) 2 、酚:氯仿:异戊醇( 25 : 24 : 1 体 积比) 3 、 3mol 醋酸钠( PH5.2 ) 4 、无水乙醇, -20 ℃保存 5 、 70% 乙醇, -20 ℃保存 6 、 TE 缓冲液

17 步骤 1 、 1.5ml Eppendorf 离心管中加入细胞裂解液 100μl 。 2 、取末梢血一滴(约 5-10μl )立即悬浮细胞裂 解液中, 37 ℃保温 2 小时。 3 、加入 100μl 酚:氯仿:异戊醇( 25 : 24 : 1 体 积比)混合液,盖紧。轻轻摇混,充分混合;室 温 15000rpm 离心 5 分钟。 4 、用开口粗的吸管转移上层水相于新的 Eppendorf 离心管,按步骤 5 重复抽提 1 次。如果 水相还混浊,增加一次酚抽提。

18 步骤 5 、转移上层水相,加入 10μl 3mol 醋酸钠 ( PH5.2 )轻摇混匀,再加入 250μl 冷无水乙醇 沉淀 DNA 。室温放置 10 分钟。 6 、 4 ℃ 15000rpm 离心 15 分钟,使 DNA 沉淀(颗 粒化)。 7 、弃上清,加 70% 冷乙醇 500μl 轻振混匀, 4 ℃ 15000rpm 离心 5 分钟。 8 、弃上清,将 Ep 管倒置在纸巾上,完全除去水 分。将 DNA 自然干燥。 9 、加 10μl TE 溶解,制成 DNA 样品。(进行 PCR 时,取 1μl 即可)。

19 二、 PCR 检测性别 试剂与材料: 1 、 上、下游引物 (各 5 μmol/L ) 2 、 模板 DNA 溶液 3 、 10×PCR 缓冲液:(高压灭菌) 4 、 dNTPs 溶液( 2.5mmol/L 原液) 5 、 Taq DNA 聚合酶( 5U/μl ) 6 、 液体石蜡(高压灭菌)

20 琼脂糖凝胶电泳分离 DNA 片段 7 、电泳级琼脂糖 8 、电泳缓冲液: 5×TBE 贮存液 9 、 5mg/ml 的溴化乙锭溶液, 4 ℃暗存。 10 、上样缓冲液: 0.25% 溴酚蓝, 0.25% 二甲苯青, 30% 甘油于水中。 4 ℃贮存。 11 、微波炉、电泳仪、水平电泳槽、制 胶模和加样孔梳齿。 12 、透射紫外灯、照相机和胶带纸。

21 实验步骤: (一)、 SRY 基因引物设计 Y ˊ -CTA GAC CGC AGA GGC GCC AT- 3 ˊ Y ˊ -TAG TAC CCA CGC CTG CTC CGG- 3 ˊ 扩增 DNA 片段长度 239bp

22 ( 二)、 PCR 反应 1 、 在 0.5ml Eppendorf 管中依次加入 H 2 O 60.5μl 10×PCR 缓冲液 10μl dNTPs 溶液( 2.5mmol/L 原液) 8μl ( 0.2mmol/L ) 上游引物 ( 5 μmol/L ) 10μl ( 0.5μmol/L ) 下游引物 ( 5 μmol/L ) 10μl ( 0.5μmol/L ) 模板 DNA 溶液(基因组 DNA 溶液) 1μl Taq DNA 聚合酶( 5U/μl ) 0.5μl ( 2.5U/100μl ) 总量 100μl

23 2 、 混匀,短暂离心。 3 、 PCR 条件 Y 1.5 / Y 1.6 PCR 扩增条件: 变性 95 ℃ 5 分钟 变性 94 ℃ 75 秒 复性 55 ℃ 90 秒 延伸 72 ℃ 150 秒 循环 30 次。 扩增产物冷却至室温可于 4 ℃保存。

24 (三)、扩增产物分析(方法参见实验四、琼脂 糖凝胶电泳分离 DNA 片段) 1 、组装制胶模。 2 、参照琼脂糖凝胶的分离能力表选择凝胶浓度 (一般为 0.8% ),称取琼脂糖,用电泳缓冲液 在沸水浴上或微波炉上将琼脂糖颗粒完全溶解。

25 3 、待胶冷却至 50 ℃左右,加入溴化乙锭 (终浓度为 0.5μg/ml ,每 10ml 加入 1μl 原 液),充分混匀后倒入胶模。 4 、向 DNA 酶解管中加入 1/10 体积的上样 缓冲液,充分混合。用微量移液器将样 品依次加入加样孔内。。

26 5 、电泳。 6 、电泳完成后可直接在透射紫外灯下 观察结果。


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