Η παρουσίαση φορτώνεται. Παρακαλείστε να περιμένετε

Η παρουσίαση φορτώνεται. Παρακαλείστε να περιμένετε

Άννα Γιοράν Τομέας Βιολογίας Κυττάρου & Βιοφυσικής, Τμήμα Βιολογίας, Εθνικό & Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών, Πανεπιστημιούπολη, Ζωγράφου, 15784, Αθήνα.

Παρόμοιες παρουσιάσεις


Παρουσίαση με θέμα: "Άννα Γιοράν Τομέας Βιολογίας Κυττάρου & Βιοφυσικής, Τμήμα Βιολογίας, Εθνικό & Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών, Πανεπιστημιούπολη, Ζωγράφου, 15784, Αθήνα."— Μεταγράφημα παρουσίασης:

1 Άννα Γιοράν Τομέας Βιολογίας Κυττάρου & Βιοφυσικής, Τμήμα Βιολογίας, Εθνικό & Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών, Πανεπιστημιούπολη, Ζωγράφου, 15784, Αθήνα Εθνικό Ίδρυμα Ερευνών, Ινστιτούτο Βιολογικών Ερευνών & Βιοτεχνολογίας, Βασ. Κων/νου 48, 11635, Αθήνα

2 Εισαγωγή H ανθρώπινη Apolipoprotein J/Clusterin (CLU) είναι μια εκκρινόμενη ετεροδιμερής γλυκοπρωτεΐνη ~ kDa η οποία εκφράζεται σχεδόν σε όλους τους ανθρώπινους ιστούς και βρίσκεται σε σχετικά μεγάλη συγκέντρωση σε όλα τα βιολογικά υγρά του ανθρώπου. Στο αίμα η CLU δρα κυρίως ως Απολιποπρωτεΐνη και εντοπίζεται στα HDL κυστίδια. Εμφανίζει επίσης δράση μοριακής συνοδού (molecular chaperon).  Ανάπτυξης  Διαφοροποίησης  Γήρανσης  Αθηροσκλήρωσης  Διαβήτη  Νευροεκφυλιστικών νόσων  Καρκινογένεσης Έχει προταθεί ότι η sCLU εμπλέκεται λειτουργικά σε μοριακές διαδικασίες:

3 Εισαγωγή

4 ΚΑΡΚΙΝΟΣ ΤΟΥ ΗΠΑΤΟΣ Ο καρκίνος του ήπατος είναι η έκτη συχνότερη κακοήθεια και η τρίτη συχνότερη αιτία θανάτου λόγω καρκίνου, παγκοσμίως. Το ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα είναι η πιο συνήθης πρωτοπαθής κακοήθεια του ήπατος στους ενήλικες. Επιθηλιακά ηπατοκαρκινώματα Ηπατοβλάστωμα Ινοπεταλιώδες καρκίνωμα Ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα ΔιαυγοκυτταρικόΘυλακώδεςΜικροί όγκοιΣκληρυντικό Συνδυασμένο ηπατικό/χολαγγειακό καρκίνωμα Μεταβατικός ηπατοκυτταρικός όγκος Μικτού τύπου καρκινώματα

5 Εισαγωγή ΚΑΡΚΙΝΟΣ ΤΟΥ ΠΑΓΚΡΕΑΤΟΣ Ο καρκίνος του παγκρέατος είναι ο 13ος πιο συχνός τύπος καρκίνου σε παγκόσμιο επίπεδο. Αρκετά συχνά έχει κακή πρόγνωση, γεγονός που τον καθιστά την 8η πιο συχνή αιτία θανάτου λόγω καρκίνου. Παγκρεατικές νεοπλασίες Νεοπλασίες παγκρεατικού πόρου Νεοπλάσματα ενδοκρινικής μοίρας Καρκίνωμα κυττάρων λοβιδίων ΠαγκρεατοβλάστωμαΆλλοι τύποι

6 Σκοπός της μελέτης......είναι η διερεύνηση του λειτουργικού ρόλου της CLU σε ανθρώπινα καρκινικά ηπατικά και παγκρεατικά κύτταρα και η καταγραφή των επαγώμενων φαινοτύπων είτε λόγω γονιδιακής υπερέκφρασης (μέθοδος διαγονιδίου - transgene) είτε μέσω επίτευξης γονιδιακής σιγής (μέθοδος μικρών RNAs παρεμβολής - siRNA) για το γονίδιο της CLU. Ιδιαίτερη έμφαση δίνεται στη λειτουργική σχέση της sCLU με το σηματοδοτικό μονοπάτι INS/IGF-1.

7 Υλικά & Μέθοδοι  Ανθρώπινες ηπατικές (HepG2 και Huh-7) και παγκρεατικές (Panc1) καρκινικές κυτταρικές σειρές. HepG2 Huh-7Panc1  Γονιδιακή υπερέκφραση CLU specific siRNA oligonucleotide  Γονιδιακή σιγή  Ποσοτικό RT-PCR  Ανοσοστύπωμα

8 Αποτελέσματα psCLU sCLU GAPDH Huh7 HepG2 86 kDa 47 kDa 34 kDa 47 kDa  Σύγκριση των ενδογενών επιπέδων έκφρασης της CLU μεταξύ των ηπατικών κυτταρικών σειρών.  Σύγκριση του πολλαπλασιαστικού δυναμικού των κυτταρικών σειρών Huh7 και ΗepG2.

9 Αποτελέσματα  Απομόνωση κλωνοποιημένου πλασμιδίου από μετασχηματισμένα βακτήρια. Πέψεις με περιοριστικές ενδονουκλεάσες.  Επιμόλυνση των κυτταρικών σειρών Huh7, HepG2 και Panc1 με το ανθρώπινο γονίδιο της CLU. Mock-24hMock-48h Vector-24h Vector-48h CLU-48h CLU-24h Huh7 HepG2 Panc1 psCLU GAPDH psCLU sCLU GAPDH psCLU sCLU GAPDH Αναμενόμενες ζώνες: BamHI: 1567 bp, 5.5 kb EcoRI: 705 bp, 872 bp, 5.5 kb

10 Αποτελέσματα  Έλεγχος της επίδρασης της υπερέκφρασης της CLU στο πολλαπλασιαστικό δυναμικό των κυττάρων Huh7, HepG2 και Panc1.

11 Αποτελέσματα  Επιμόλυνση των κυτταρικών σειρών Huh7, HepG2 και Panc1 με sCLU-ειδικά siRNAs για τη μερική σίγηση της έκφρασης του γονιδίου CLU. Mock Scramble siRNA Mock Scramble siRNA Huh7 HepG2 Panc1 GAPDH CLU 48h 72h Mock Scramble siRNA CLU GAPDH CLU GAPDH  Έλεγχος της επίδρασης της μερικής σίγησης του γονιδίου της CLU στο πολλαπλασιαστικό δυναμικό των κυττάρων.

12 Αποτελέσματα  Έλεγχος της επίδρασης της υπερέκφρασης της CLU στην έκφραση γονιδίων που συμμετέχουν στο σηματοδοτκό μονοπάτι INS/IGF-1.  Έλεγχος με RT-PCR.  Έλεγχος με ανοσοστύπωμα κατά Western. Mock-24h Mock-48h Vector-24h Vector-48h CLU-24h CLU-48h ERK-1 p-Akt Akt GAPDH mTOR GAPDH SOS1 Huh7 HepG2 Panc1 Mock-48h Vector-24h Vector-48h CLU-48h CLU-24h Mock-24h Mock-48h Vector-24h Vector-48h CLU-48h CLU-24h Mock-24h ERK-1 p-Akt Akt GAPDH mTOR GAPDH SOS1 ERK-1 GAPDH mTOR p-ERK p-mTOR SOS1 GAPDH

13 Αποτελέσματα  Έλεγχος της επίδρασης της μερικής σίγησης της CLU στα επίπεδα έκφρασης πρωτεϊνών που συμμετέχουν στο σηματοδοτικό μονοπάτι INS/IGF-1.  Έλεγχος με ανοσοστύπωμα κατά Western.  Έλεγχος με RT-PCR. Panc1 HepG2 Huh7 Panc1 ERK-1 Akt GAPDH mTOR GAPDH SOS1 GAPDH Mock Scramble siRNA ERK-1 Akt GAPDH mTOR GAPDH SOS1 GAPDH Mock Scramble siRNA MockScramble siRNA Akt ERK-1 GAPDH mTOR p-ERK p-Akt GAPDH p-mTOR GAPDH

14 Αποτελέσματα  Έλεγχος με ανοσοστύπωμα κατά Western / ποσοτικοποίηση ζωνών. Huh7 HepG2 Panc1 Υπερέκφραση sCLUΣίγηση sCLU

15 Αποτελέσματα  Έλεγχος επίδρασης του χημειοθεραπευτικού φαρμάκου Doxorubicin (DXR) στο πολλαπλασιαστικό δυναμικό των κυττάρων και στην επαγωγή κυτταρικού θανάτου.

16 Συμπεράσματα Τα ενδογενώς υψηλά επίπεδα έκφρασης της CLU σε καρκινικά κύτταρα ενδεχομένως συμβάλλουν σε μείωση του πολλαπλασιαστικού δυναμικού και στην εμφάνιση χημειοανθεκτικότητας. Εξωγενώς επαγώμενη υπερέκφραση της CLU μειώνει το πολλαπλασιαστικό δυναμικό ηπατικών και παγκρεατικών καρκινικών κυττάρων. Μείωση των επιπέδων έκφρασης της CLU αυξάνει το ρυθμό αύξησης ηπατικών και παγκρεατικών καρκινικών κυττάρων. Ενδεχομένως οι αλλαγές στην έκφραση της CLU να επηρεάζουν τα επίπεδα έκφρασης του γονιδίου mTOR. Σύμφωνα με τα προκαταρκτικά πειράματα μας, τα επίπεδα έκφρασης της CLU δεν φαίνεται να επηρεάζουν άμεσα το μονοπάτι σηματοδότησης INS/IGF-1.

17 Ευχαριστίες... Εθνικό Ίδρυμα Ερευνών: Ευστάθιος Σ. Γκόνος Νίκη Χονδρογιάννη Επιστημονικό προσωπικό του Προγράμματος Μοριακής και Κυτταρικής Γήρανσης ΕΚΠΑ, Τμήμα Βιολογίας: Ιωάννης Π. Τρουγκάκος (επιβλέπων) Λουκάς Χ. Μαργαρίτης Ιωάννης Γρίβας Ελένη Τσακίρη


Κατέβασμα ppt "Άννα Γιοράν Τομέας Βιολογίας Κυττάρου & Βιοφυσικής, Τμήμα Βιολογίας, Εθνικό & Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών, Πανεπιστημιούπολη, Ζωγράφου, 15784, Αθήνα."

Παρόμοιες παρουσιάσεις


Διαφημίσεις Google