Η παρουσίαση φορτώνεται. Παρακαλείστε να περιμένετε

Η παρουσίαση φορτώνεται. Παρακαλείστε να περιμένετε

1 Ανάλυση της αλληλουχίας των γονιδιωμάτων. Μέθοδος συνεχών κλώνων / Συναρμολόγηση χαρτογραφημένων τμημάτων Αλληλούχηση τυχαίων τμημάτων ολικού γονιδιώματος.

Παρόμοιες παρουσιάσεις


Παρουσίαση με θέμα: "1 Ανάλυση της αλληλουχίας των γονιδιωμάτων. Μέθοδος συνεχών κλώνων / Συναρμολόγηση χαρτογραφημένων τμημάτων Αλληλούχηση τυχαίων τμημάτων ολικού γονιδιώματος."— Μεταγράφημα παρουσίασης:

1 1 Ανάλυση της αλληλουχίας των γονιδιωμάτων

2 Μέθοδος συνεχών κλώνων / Συναρμολόγηση χαρτογραφημένων τμημάτων Αλληλούχηση τυχαίων τμημάτων ολικού γονιδιώματος / Μέθοδος τυχαίας προσπέλασης 2

3 Αλληλούχηση τυχαίων τμημάτων ολικού γονιδιώματος Αλληλούχηση τυχαίων τμημάτων ολικού γονιδιώματος Μέθοδος τυχαίας προσπέλασης Μέθοδος τυχαίας προσπέλασης Whole genome shotgun method Whole genome shotgun method 3

4  Craig Venter, 1990, για βακτηριακά γονιδιώματα: ◦ Πρόοδος τεχνολογίας αλληλούχησης ◦ Αυξανόμενη υπολογιστική ισχύς  Δημιουργία κλώνων πολλών χιλιάδων μικρών τμημάτων (σε ισάριθμα πλασμίδια)  Μαζική αλληλούχηση τυχαίων κλώνων  Συναρμολόγηση των αναγνώσεων χωρίς πρότερη γνώση της θέσης τους στο γονιδίωμα 4

5  Γονιδίωμα μεγέθους 1,8Mbp  Στις αρχές του 1990, το μεγαλύτερο γονιδίωμα που είχε αλληλουχηθεί: κυτταρομεγαλοϊός ~0,23Mbp  Venter – πρόταση στρατηγικής τυχαίας προσπέλασης για την αλληλούχηση του H. influenzae: ◦ Σημαντικό στην ιατρική ◦ Μικρό γονιδίωμα ◦ Ανυπαρξία φυσικού χάρτη ◦ Περιεχόμενο G+C = ~38% (όσο και του ανθρώπου) 5

6  Τα βήματα ◦ Κλασματοποίηση μέσω υπερήχων ◦ Απομόνωση τμημάτων kb ◦ Κλωνοποίηση (19,687 κλώνοι) ◦ Αλληλούχηση με χρήση 14 πρωτότυπων αυτόματων συσκευών αλληλούχησης ◦ Συναρμολόγηση (30 ώρες σε υπολογιστή με RAM 512 Mbytes)  Αποτελέσματα ◦ 11,631,485 bp, ≈6x το γονιδίωμα ◦ 140 contigs ◦ 50 χάσματα 6

7 7

8 8

9 Αποτελέσματα  Συνεχής αλληλουχία bp  Εντοπισμός 1743 περιοχών που θα πρέπει να κωδικοποιούν πρωτεΐνες 9

10 10 ΕΙΚΟΝΑ 10.16: ΕΙΚΟΝΑ 10.16: Χάρτης της αλληλουχίας του γονιδιώματος του Hemophilus influenzae.

11  Η προσέγγιση της τυχαίας προσπέλασης έχει καθιερωθεί για γονιδιώματα από 10 6 έως 3x10 9 bp.  Ένα μεγάλο εργαστήριο αλληλούχησης «διαβάζει» το γονιδίωμα ενός μικροβίου σε μία ημέρα  Από τα πρώτα κίνητρα για την αλληλούχηση μικροβιακών γονιδιωμάτων ήταν οι εφαρμογές στην Ιατρική  Όμως, η πρόκληση ήταν η αλληλούχηση του ανθρώπινου γονιδιώματος, μεγέθους 3x10 9 bp. 11

12  Γιατί κλασματοποίηση μέσω υπερήχων (και όχι ενζύμων περιορισμού); 12  Για τη δημιουργία «τυχαίων» και «αλληλεπικαλυπτόμενων» τμημάτων DNA  Ώστε να υπάρχουν όλες οι αλληλουχίες σε τμήματα των kb

13 13 2 kb0.5 kb3.5 kb1.8 kb 2 kb 1.8 kb Τμήματα εύρους kb Πέψη με ένζυμο περιορισμού

14 14

15  Πόσους κλώνους χρειάζεται να αλληλουχήσουμε για να είμαστε σίγουροι ότι καλύψαμε το γονιδίωμα με τους αλληλεπικαλυπτόμενους κλώνους; 15 ≈ 6-10 x

16  Σημασία του βαθμού κάλυψης (fold coverage)  Ποια η πιθανότητα μια τυχαία βάση να μην αλληλουχηθεί; P 0 =e -m, όπου m είναι ο βαθμός κάλυψης  Άρα, με κάλυψη 1x, P 0 = 2,73 -1 = 0,37. δηλαδή, το 37% του γονιδιώματος δεν θα αλληλουχηθεί  6x, 1-P 0 =99,75%  10x, 1-P 0 =99,995% Ερώτημα: Πόσους πλασμιδιακούς κλώνους με μέσο μήκος ένθεσης 3kb χρειάζεστε για να είστε σίγουροι κατά 99,75% ότι έχετε κλωνοποιήσει μια συγκεκριμένη ανθρώπινη αλληλουχία; 16

17 Συναρμολόγηση χαρτογραφημένων τμημάτων Συναρμολόγηση χαρτογραφημένων τμημάτων Clone contig method Clone contig method 17

18 1. Κατακερματισμός του DNA σε κλάσματα μήκους έως 1.5 Mb (μερική πέψη) 2. Κλωνοποίηση κλασμάτων σε φορείς μεγάλης χωρητικότητας 3. Χαρτογράφηση κλασμάτων στα χρωμοσώματα 4. Καθορισμός της αλληλουχίας των μεγάλων κλασμάτων μέσω τυχαίας προσπέλασης (shotgun sequencing) και συναρμολόγησης ΔΔημιουργία μικρότερων κλασμάτων ΚΚλωνοποίηση σε πλασμιδιακούς φορείς ΑΑλληλούχηση συζευγμένων άκρων (paired-end sequencing) ΔΔημιουργία συναρμολογημάτων (contigs) 18

19 1. Κατακερματισμός του DNA σε κλάσματα μήκους έως 1.5 Mb (μερική πέψη) 2. Κλωνοποίηση κλασμάτων σε φορείς μεγάλης χωρητικότητας 3. Χαρτογράφηση κλασμάτων στα χρωμοσώματα 4. Καθορισμός της αλληλουχίας των μεγάλων κλασμάτων μέσω τυχαίας προσπέλασης (shotgun sequencing) και συναρμολόγησης  Δημιουργία μικρότερων κλασμάτων  Κλωνοποίηση σε πλασμιδιακούς φορείς  Αλληλούχηση συζευγμένων άκρων (paired-end sequencing)  Δημιουργία συναρμολογημάτων (contigs) 19

20 Το πλήθος των κλώνων που απαιτούνται προς αλληλούχηση είναι αντίστροφα ανάλογο με το μέγεθος των ενθέσεων γονιδιωματικού DNA που περιέχουν οι κλώνοι 20

21 21

22 1. Κατακερματισμός του DNA σε κλάσματα μήκους έως 1.5 Mb (μερική πέψη) 2. Κλωνοποίηση κλασμάτων σε φορείς μεγάλης χωρητικότητας 3. Χαρτογράφηση κλασμάτων στα χρωμοσώματα 4. Καθορισμός της αλληλουχίας των μεγάλων κλασμάτων μέσω τυχαίας προσπέλασης (shotgun sequencing) και συναρμολόγησης  Δημιουργία μικρότερων κλασμάτων  Κλωνοποίηση σε πλασμιδιακούς φορείς  Αλληλούχηση συζευγμένων άκρων (paired-end sequencing)  Δημιουργία συναρμολογημάτων (contigs) 22

23  Φυσικοί χάρτες μέσω RE αποτυπωμάτων κλώνων με μεγάλες ενθέσεις ◦ Μερική πέψη με HindIII ή MboI για δημιουργία τμημάτων DNA ~170kb ◦ Βιβλιοθήκη BAC ◦ Πέψη απομονωμένων κλώνων με ένζυμο περιορισμού και ηλεκτροφόρηση ◦ Σύγκριση «αποτυπωμάτων» για την αποκάλυψη αλληλεπικαλυπτόμενων κλώνων 23

24 24 ΕΙΚΟΝΑ 11.9: ΕΙΚΟΝΑ 11.9: Η ανάλυση αποτυπωμάτων χρησιμοποιείται για τη χαρτογράφηση και τη συναρμολόγηση κλώνων τεχνητών χρωμοσωμάτων βακτηρίων (BAC).

25  Ετικέτες μικρού μήκους χρησιμεύουν για τον προσδιορισμό του προσανατολισμού και της διαδοχικής σειράς γονιδιωματικών κλώνων ◦ Ενώ ένα STS αντιπροσωπεύει ένα φυσικό τμήμα DNA μοναδικό στο γονιδίωμα, δεν χρειάζεται ένας κλώνος αλλά μπορεί να παραχθεί μέσω μιας PCR ◦ Η PCR είναι ταχύτερη και πιο εύχρηστη από το στύπωμα κατά Southern 25

26 26 ΕΙΚΟΝΑ 11.10: ΕΙΚΟΝΑ 11.10: Χαρτογράφηση με βάση την ανίχνευση STS σε κλώνους BAC.

27  1990: Οι Cox και Myers βελτίωσαν μια παλιά (Goss and Harris, 1975) μέθοδο δημιουργίας υβριδίων κυττάρων τρωκτικών και ανθρώπου 27

28 28 ΕΙΚΟΝΑ 11.11: ΕΙΚΟΝΑ 11.11: Παραγωγή σειρών υβριδίων ακτινοβολημένων κυττάρων με σκοπό τη χαρτογράφηση του γονιδιώματος. Οι Goss & Harris δημιούργησαν υβριδικά κύτταρα με πολύ μικρά τμήματα ανθρώπινων χρωμοσωμάτων (ισχυρές δόσεις ακτίνων Χ). Στη συνέχεια προκάλεσαν σύντηξη με κύτταρα τρωκτικών και απομόνωσαν κυτταρικές σειρές κάθε μία των οποίων είχε ένα μόνο τμήμα ανθρώπινου γονιδιώματος. Τέλος, έκαναν μελέτες σύνδεσης στα υβριδικά κύτταρα, προσδιορίζοντας τη συχνότητα με την οποία δύο γονίδια (ή δείκτες) συγκληρονομούνταν (βρίσκονταν μαζί σε ένα σετ υβριδίων).

29  Οι Cox και Meyers δημιούργησαν ένα σετ 90 ακτινοβολημένων υβριδίων  Οι σειρές αυτές γονοτυπήθηκαν για την παρουσία ή απουσία χιλιάδων STSs  Τα πρότυπα παρουσίας/απουσίας των STSs συγκρίθηκαν ώστε να προβλεφθεί η πιθανή σχετική διάταξη των STSs καθώς και η απόσταση μεταξύ τους 29

30 30 ΕΙΚΟΝΑ 11.12: ΕΙΚΟΝΑ 11.12: Εφαρμογή της χαρτογράφησης μέσω ανάλυσης υβριδίων ακτινοβολημένων κυττάρων (RH, Radiation Hybrid) για τον προσδιορισμό της διάταξης ετικετών θέσεων αλληλουχίας (STS, Sequence-Tagged Sites). Αν η εμφάνιση δυο STSs (πχ 1 και 19) σε πολλές κυτταρικές σειρές είναι πιο συχνή από ό,τι θα αναμενόταν τυχαία, δείχνει ότι αυτοί οι δύο δείκτες έχουν μικρή απόσταση μεταξύ τους.

31  Παρότι η διακριτική ικανότητα ενός τέτοιου χάρτη είναι χαμηλή, αποτελεί έναν ανεξάρτητο τρόπο προσδιορισμού της διάταξης τμημάτων DNA  Χρησιμοποιήθηκαν δύο τέτοιες προσεγγίσεις: ◦ Ο ένας χάρτης είχε διακριτική ικανότητα ~1,5 εκατ bp ◦ Ο άλλος ~400,000 bp 31

32 A complete coverage, sequence-ready BAC contig in the chromosome 16p(13.1–11.2) region 51 BAC κλώνοι (πορτοκαλί) αλληλουχήθηκαν πλήρως 183 BAC κλώνοι (μπλε) στοιχήθηκαν με τους αλληλουχημένους κλώνους βάσει ομολογίας των άκρων τους 55 BAC κλώνοι (πράσινο) συναρμολογήθηκαν στο contig βάσει restriction fingerprint analysis. Τα μεγέθη όλων των κλώνων έχουν καθοριστεί Συνολικά 76 BACs (λευκοί ρόμβοι) στο εσωτερικό των παραλληλογράμμων των κλώνων χαρτογραφήθηκαν με FISH και παρείχαν σημεία αγκυροβόλησης στα χρωμοσώματα 32

33 1. Κατακερματισμός του DNA σε κλάσματα μήκους έως 1.5 Mb (μερική πέψη) 2. Κλωνοποίηση κλασμάτων σε φορείς μεγάλης χωρητικότητας 3. Χαρτογράφηση κλασμάτων στα χρωμοσώματα 4. Καθορισμός της αλληλουχίας των μεγάλων κλασμάτων μέσω τυχαίας προσπέλασης (shotgun sequencing) και συναρμολόγησης  Δημιουργία μικρότερων κλασμάτων  Κλωνοποίηση σε πλασμιδιακούς φορείς  Αλληλούχηση συζευγμένων άκρων (paired-end sequencing)  Δημιουργία συναρμολογημάτων (contigs) 33

34 34 ΕΙΚΟΝΑ 10.5: ΕΙΚΟΝΑ 10.5: Δημιουργία πλασμιδιακής βιβλιοθήκης υποκλωνοποίησης για αλληλούχηση συζευγμένων άκρων.

35 1. Κατακερματισμός του DNA σε κλάσματα μήκους έως 1.5 Mb (μερική πέψη) 2. Κλωνοποίηση κλασμάτων σε φορείς μεγάλης χωρητικότητας 3. Χαρτογράφηση κλασμάτων στα χρωμοσώματα 4. Καθορισμός της αλληλουχίας των μεγάλων κλασμάτων μέσω τυχαίας προσπέλασης (shotgun sequencing) και συναρμολόγησης  Δημιουργία μικρότερων κλασμάτων  Κλωνοποίηση σε πλασμιδιακούς φορείς  Αλληλούχηση συζευγμένων άκρων (paired-end sequencing)  Δημιουργία συναρμολογημάτων (contigs) 35

36 36 ΕΙΚΟΝΑ 10.4: ΕΙΚΟΝΑ 10.4: Η αλληλούχηση συζευγμένων άκρων (paired-end sequencing) συμβάλλει στην αποφυγή λαθών κατά τη συναρμολόγηση των αναγνώσεων αλληλουχίας.

37 37 ΕΙΚΟΝΑ 10.6: ΕΙΚΟΝΑ 10.6: Η αλληλεπικάλυψη των κλώνων διευκολύνει την ταυτοποίηση της αλληλουχίας περιοχών επαναλαμβανόμενου DNA.

38 38

39 39

40  … τα χάσματα όμως παραμένουν… 40

41 41 EIKONA 10.14: EIKONA 10.14: Συναρμολόγηση της αλληλουχίας μιας περιοχής μεγάλου μήκους από πολλές αναγνώσεις αλληλουχίας μικρού μήκους.

42 42 ΕΙΚΟΝΑ 10.15: ΕΙΚΟΝΑ 10.15: Κατά τη συναρμολόγηση των αλληλουχιών μπορεί να παρουσιαστούν αρκετά προβλήματα.

43 Ανασυνδυασμένο DNA 43Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2007 Human Genome Projects ή Πώς αλληλουχήθηκε το ανθρώπινο γονιδίωμα

44 Λίγη ιστορία Αρχές 1980: Robert Sinsheimer (πρύτανης του UC Santa Cruz) απέτυχε να συγκεντρώσει αρκετά χρήματα για την κατασκευή του μεγαλύτερου τηλεσκοπίου στον κόσμο. Ίσως όμως να ήταν αρκετά για τη δημιουργία Κέντρου Γονιδιωματικής. Όμως, οι χρηματοδότες δεν πείσθηκαν. Αρχές 1980: Robert Sinsheimer (πρύτανης του UC Santa Cruz) απέτυχε να συγκεντρώσει αρκετά χρήματα για την κατασκευή του μεγαλύτερου τηλεσκοπίου στον κόσμο. Ίσως όμως να ήταν αρκετά για τη δημιουργία Κέντρου Γονιδιωματικής. Όμως, οι χρηματοδότες δεν πείσθηκαν. Μάιος 1985: συνάντηση σε Santa Cruz, με αυθεντίες όπως Bolstein, Gilbert, Lee Hood, Sulston, περί ενδιαφέροντος και δυνατότητας αλληλούχησης του ανθρώπινου γονιδιώματος. Μάιος 1985: συνάντηση σε Santa Cruz, με αυθεντίες όπως Bolstein, Gilbert, Lee Hood, Sulston, περί ενδιαφέροντος και δυνατότητας αλληλούχησης του ανθρώπινου γονιδιώματος. 1988: Ο Charles DeLisi, Υπουργός Ενέργειας των ΗΠΑ παραχωρεί κονδύλια του προϋπολογισμού για Πρόγραμμα Ανθρώπινου Γονιδιώματος 1988: Ο Charles DeLisi, Υπουργός Ενέργειας των ΗΠΑ παραχωρεί κονδύλια του προϋπολογισμού για Πρόγραμμα Ανθρώπινου Γονιδιώματος Ανασυνδυασμένο DNA 44Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2007

45 45

46 46

47 47

48 48

49 49

50 Οι συμμετέχοντες 50

51 Πού πραγματικά θα γίνει; 51

52 Δεδομένων των προβλημάτων… Γιατί να μην επικεντρωθούν οι προσπάθειες στα μοναδικά τμήματα του γονιδώματος; Γιατί να μην επικεντρωθούν οι προσπάθειες στα μοναδικά τμήματα του γονιδώματος; Μέσω υβριδοποίησης θα μπορούσε να γίνει αρνητική επιλογή των υποκλώνων που περιέχουν επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες και αφαίρεσή τους από τη «γραμμή» αλληλούχησης. Μέσω υβριδοποίησης θα μπορούσε να γίνει αρνητική επιλογή των υποκλώνων που περιέχουν επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες και αφαίρεσή τους από τη «γραμμή» αλληλούχησης. 52

53 Αλληλούχηση cDNA Sydney Brenner: Η αλληλούχηση μόνο των cDNA θα μείωνε έως και 100 φορές τον όγκο της αλληλούχησης. Αλλά δεν έβρισκε χρηματοδότηση Sydney Brenner: Η αλληλούχηση μόνο των cDNA θα μείωνε έως και 100 φορές τον όγκο της αλληλούχησης. Αλλά δεν έβρισκε χρηματοδότηση 53

54 1991. O Craig Venter (τότε στο ΝΙΗ) ανέφερε ότι είχε αλληλουχήσει ~600 ESTs από εγκεφαλικό ιστό O Craig Venter (τότε στο ΝΙΗ) ανέφερε ότι είχε αλληλουχήσει ~600 ESTs από εγκεφαλικό ιστό Το ΝΙΗ επεδίωξε να κατοχυρώσει πνευματικά δικαιώματα για τα ESTs αλλά προκάλεσε έντονες αντιδράσεις και ανέκρουσε πρύμνη Το ΝΙΗ επεδίωξε να κατοχυρώσει πνευματικά δικαιώματα για τα ESTs αλλά προκάλεσε έντονες αντιδράσεις και ανέκρουσε πρύμνη Ο Venter εγκατέλειψε το ΝΙΗ και ίδρυσε το The Institute of Genome Research (TIGR) όπου κατοχύρωνε τα ESTs Ο Venter εγκατέλειψε το ΝΙΗ και ίδρυσε το The Institute of Genome Research (TIGR) όπου κατοχύρωνε τα ESTs Η απάντηση από μια ομάδα φαρμακευτικών εταιρειών (Merck and Co) που αλληλουχούσαν ESTs στο Washington U και τα διέθεταν σε δημόσιες βάσεις δεδομένων Η απάντηση από μια ομάδα φαρμακευτικών εταιρειών (Merck and Co) που αλληλουχούσαν ESTs στο Washington U και τα διέθεταν σε δημόσιες βάσεις δεδομένων 54

55 Γενετικοί χάρτες Η δημιουργία γενετικών και φυσικών χαρτών κρίθηκε απαραίτητη για τη διευκόλυνση της συναρμολόγησης των αλληλουχιών Η δημιουργία γενετικών και φυσικών χαρτών κρίθηκε απαραίτητη για τη διευκόλυνση της συναρμολόγησης των αλληλουχιών Ως το 1979 είχαν εντοπιστεί ~200 γονίδια σε διάφορα ανθρώπινα χρωμοσώματα, συνδυάζοντας τη μελέτη οικογενών ανωμαλιών με την ανάλυση υβριδικών σωματικών κυττάρων Ως το 1979 είχαν εντοπιστεί ~200 γονίδια σε διάφορα ανθρώπινα χρωμοσώματα, συνδυάζοντας τη μελέτη οικογενών ανωμαλιών με την ανάλυση υβριδικών σωματικών κυττάρων Ανασυνδυασμένο DNA 55Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2007

56 Εν αρχή ην… RFLPs Οι πρώτοι χάρτες (White et al, U of Utah and Helen Donis-Keller et al, Collaborative Research Inc) έφεραν ~400 RFLP δείκτες Οι πρώτοι χάρτες (White et al, U of Utah and Helen Donis-Keller et al, Collaborative Research Inc) έφεραν ~400 RFLP δείκτες Όχι τυχαία κατανομή, άρα όχι ομοιόμορφη κάλυψη του γονιδιώματος Όχι τυχαία κατανομή, άρα όχι ομοιόμορφη κάλυψη του γονιδιώματος 1990: χαρτογράφηση 2000 γονιδίων και 5000 τμημάτων DNA 1990: χαρτογράφηση 2000 γονιδίων και 5000 τμημάτων DNA Ανασυνδυασμένο DNA 56Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2007

57 Single Sequence Repeats 1993: Χάρτης 2000 χαρτογραφημένων CA επαναλήψεων από τη Genethon (Παρίσι) που κάλυπτε 90% του γονιδιώματος 1993: Χάρτης 2000 χαρτογραφημένων CA επαναλήψεων από τη Genethon (Παρίσι) που κάλυπτε 90% του γονιδιώματος 1993: Χάρτης τρι- και τετρα-νουκλεοτιδικών επαναλήψεων από Cooperative Human Linkage Center (ΗΠΑ) 1993: Χάρτης τρι- και τετρα-νουκλεοτιδικών επαναλήψεων από Cooperative Human Linkage Center (ΗΠΑ) 1994: Συνολικός χάρτης 5870 πολυμορφικών δεικτών με μέση απόσταση μεταξύ τους 0,7 cM (~700 kb) και από τις δύο εταιρείες μαζί 1994: Συνολικός χάρτης 5870 πολυμορφικών δεικτών με μέση απόσταση μεταξύ τους 0,7 cM (~700 kb) και από τις δύο εταιρείες μαζί Ανασυνδυασμένο DNA 57Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2007

58 1993: Χάρτης 2000 χαρτογραφημένων CA επαναλήψεων από τη Genethon (Παρίσι) που κάλυπτε 90% του γονιδιώματος 1993: Χάρτης 2000 χαρτογραφημένων CA επαναλήψεων από τη Genethon (Παρίσι) που κάλυπτε 90% του γονιδιώματος 1993: Χάρτης τρι- και τετρα-νουκλεοτιδικών επαναλήψεων από Cooperative Human Linkage Center (ΗΠΑ) 1993: Χάρτης τρι- και τετρα-νουκλεοτιδικών επαναλήψεων από Cooperative Human Linkage Center (ΗΠΑ) 1994: Συνολικός χάρτης 5870 πολυμορφικών δεικτών με μέση απόσταση μεταξύ τους 0,7 cM (~700 kb) και από τις δύο εταιρείες μαζί 1994: Συνολικός χάρτης 5870 πολυμορφικών δεικτών με μέση απόσταση μεταξύ τους 0,7 cM (~700 kb) και από τις δύο εταιρείες μαζί Ανασυνδυασμένο DNA 58Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2007

59 Ανασυνδυασμένο DNA 59 ΕΙΚΟΝΑ 11.7: ΕΙΚΟΝΑ 11.7: Γενετικός χάρτης του χρωμοσώματος 4 που σχεδιάστηκε με βάση μικροδορυφορικούς δείκτες. Οι θέσεις των δεικτών αυτών και οι γενετικές τους αποστάσεις προσδιορί- στηκαν ακολουθώντας την κληρονόμηση των αλληλομόρφων κάθε δείκτη σε ένα καθορισμένο σύνολο μεγάλων οικογενειών.

60 Αργοί ρυθμοί αλληλούχησης τα πρώτα 8 χρόνια ( ) Δημιουργία χαρτών ήταν η κύρια προτεραιότητα Δημιουργία χαρτών ήταν η κύρια προτεραιότητα Ποτέ πριν αλληλούχηση σε τέτοια κλίμακα Ποτέ πριν αλληλούχηση σε τέτοια κλίμακα νέες τεχνολογίες νέες τεχνολογίες απειρία αντιμετώπισης περιοχών με επαναλήψεις απειρία αντιμετώπισης περιοχών με επαναλήψεις Απαίτηση συντονισμού υψηλού επιπέδου εργαστηρίων από όλο τον κόσμο, εφαρμογή βιομηχανικών αρχών και προγραμματισμού παραγωγής Απαίτηση συντονισμού υψηλού επιπέδου εργαστηρίων από όλο τον κόσμο, εφαρμογή βιομηχανικών αρχών και προγραμματισμού παραγωγής Ανασυνδυασμένο DNA 60Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2007

61 Συνεργασία αλλά και ανταγωνισμός Συνεργασία αλλά και ανταγωνισμός Εμπειρία μέσω αλληλούχησης μικρότερων γονιδιωμάτων (S. cerevisiae, C. elegans) Εμπειρία μέσω αλληλούχησης μικρότερων γονιδιωμάτων (S. cerevisiae, C. elegans) Νέες χρηματοδοτήσεις Νέες χρηματοδοτήσεις Ανασυνδυασμένο DNA 61Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2007

62 Θα υπάρχουν πατέντες; (ένα από τα πολλά ενδιαφέροντα των εταιρειών) Ανασυνδυασμένο DNA 62Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2007

63 Αρχές των Βερμούδων 1996: Διεθνής διάσκεψη στις Βερμούδες χρηματοδοτούμενη από το Wellcome Trust 1996: Διεθνής διάσκεψη στις Βερμούδες χρηματοδοτούμενη από το Wellcome Trust Αυτόματη δημοσίευση αλληλουχιών μέσα σε 24 ώρες σε δημόσιες βάσεις δεδομένων (δηλαδή πριν από τη δημοσίευση των σχετικών άρθρων) Αυτόματη δημοσίευση αλληλουχιών μέσα σε 24 ώρες σε δημόσιες βάσεις δεδομένων (δηλαδή πριν από τη δημοσίευση των σχετικών άρθρων) 63 Διασφάλιζε τη διάθεση των αποτελεσμάτων σε όλη την επιστημονική κοινότητα Διασφάλιζε τη διάθεση των αποτελεσμάτων σε όλη την επιστημονική κοινότητα Εμπόδιζε τις προσπάθειες κατοχύρωσης με διπλώματα ευρεσιτεχνίας Εμπόδιζε τις προσπάθειες κατοχύρωσης με διπλώματα ευρεσιτεχνίας

64 64  Πρόταση του Venter για διακοπή της επιχορήγησης του IHGSC

65 Το Wellcome Trust διπλασίασε την οικονομική ενίσχυση (και "απείλησε" ότι θα αναλάβει όλο το κόστος του προγράμματος σε περίπτωση που η κυβέρνηση των ΗΠΑ το εγκατέλειπε). Το αμερικανικό Κογκρέσο απέρριψε την πρόταση του Venter για διακοπή της επιχορήγησης του IHGSC Ανασυνδυασμένο DNA 65Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2007

66 H Celera πρώτα εφάρμοσε την προσέγγιση της τυχαίας προσπέλασης στη Δροσόφιλα: H Celera πρώτα εφάρμοσε την προσέγγιση της τυχαίας προσπέλασης στη Δροσόφιλα: Κατάτμησε και κλωνοποίησε το γονιδίωμα της δροσόφιλας σε τρεις διαφορετικές βιβλιοθήκες Κατάτμησε και κλωνοποίησε το γονιδίωμα της δροσόφιλας σε τρεις διαφορετικές βιβλιοθήκες Αλληλούχησε και από τα δύο άκρα 1,5 εκατ κλώνους Αλληλούχησε και από τα δύο άκρα 1,5 εκατ κλώνους Ο Eugene Meyers ανέπτυξε νέους αλγόριθμους για τη συναρμολόγηση Ο Eugene Meyers ανέπτυξε νέους αλγόριθμους για τη συναρμολόγηση Κάλυψη των 2/3 του γονιδιώματος Κάλυψη των 2/3 του γονιδιώματος Όχι χρωματίνη Όχι χρωματίνη Σημαντικός αριθμός χασμάτων Σημαντικός αριθμός χασμάτων Πρώτη πρόχειρη και πολύ χρήσιμη εφαρμογή της τυχαίας προσπέλασης Πρώτη πρόχειρη και πολύ χρήσιμη εφαρμογή της τυχαίας προσπέλασης 66

67 Για το ανθρώπινο γονιδίωμα η Celera: χρησιμοποίησε ως DNA-μήτρα κλώνους με μικρές ενθέσεις παρήγαγε > 27 εκατ αναγνώσεις σε λιγότερο από 1 χρόνο Μέσα σε 2 χρόνια συναρμολόγησε την αλληλουχία Το IHGSC με τους Francis Collins (NIH), Michael Morgan (Wellcome Trust) και Αριστείδη Πατρινό (Υπουργείο Ενέργειας, ΗΠΑ) συντόνισαν 20 κέντρα γονιδιωματικής σε όλο τον κόσμο για τη συμπλήρωση των χασμάτων 67

68 Η εκεχειρία Ανασυνδυασμένο DNA 68Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2007

69 Φεβρουάριος 2001 Φεβρουάριος 2001 IHGSC σε Nature: IHGSC σε Nature: αλληλούχηση 29,298 χαρτογραφημένων κλώνων, κυρίως BAC αλληλούχηση 29,298 χαρτογραφημένων κλώνων, κυρίως BAC 7,5 φορές κάλυψη 7,5 φορές κάλυψη 46% του γονιδιώματος υπό μορφή συναρμολογημάτων >100 kb 46% του γονιδιώματος υπό μορφή συναρμολογημάτων >100 kb Το μεγαλύτερο συναρμολόγημα 28,5 Μb Το μεγαλύτερο συναρμολόγημα 28,5 Μb χάσματα χάσματα Celera σε Science: Celera σε Science: Κάλυψη: 5,1x. Σε συνδυασμό με IHGSC: 12,6x Κάλυψη: 5,1x. Σε συνδυασμό με IHGSC: 12,6x 49% του γονιδιώματος υπό μορφή συναρμολογημάτων >100 kb 49% του γονιδιώματος υπό μορφή συναρμολογημάτων >100 kb Το μεγαλύτερο συναρμολόγημα 2 Mb Το μεγαλύτερο συναρμολόγημα 2 Mb χάσματα χάσματα Ανασυνδυασμένο DNA 69Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2007

70 Ανασυνδυασμένο DNA 70Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2007 ΠΙΝΑΚΑΣ 11.1: ΠΙΝΑΚΑΣ 11.1: Στη Διεθνή Κοινοπραξία Αλληλούχησης του Ανθρώπινου Γονιδιώματος (International Human Genome Sequencing Consortium) συμμετείχαν 20 διαφορετικά κέντρα από έξι χώρες. 1. SC: Wellcome Trust Sanger Institute (Hinxton, UK) 2. WUGSC: Washington U Genome Sequencing Center (St Louis, Missouri) 3. WIBR: Whitehead Institute of Biomedical Research (Cambridge, MA) 4. JGI/SHGC: US DOE Joint Genome Institute and Stanford Human Genome Center (Walnut Creek and Stanford, CA) 5. BCM: Baylor College of Medicine Human Genome Sequencing Center (Houston, Texas)

71 Τα επιτεύγματα Ανασυνδυασμένο DNA 71Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2007

72 0 Ανασυνδυασμένο DNA 72Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2007 Date achieved

73 Ανασυνδυασμένο DNA 73Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2007

74 Ανασυνδυασμένο DNA 74Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2007 ΕΙΚΟΝΑ 11.13: ΕΙΚΟΝΑ 11.13: Η διαδικασία ολοκλήρωσης της αλληλούχησης του γονιδιώματος.

75 Μέτρο πιθανότητας (probability score): η πιθανότητα μιας νουκλεοτιδικής θέσης να έχει ταυτοποιηθεί με λάθος τρόπο Μέτρο πιθανότητας (probability score): η πιθανότητα μιας νουκλεοτιδικής θέσης να έχει ταυτοποιηθεί με λάθος τρόπο Ακόμα εντυπωσιακότερη, όμως, είναι η μείωση των χασμάτων Ακόμα εντυπωσιακότερη, όμως, είναι η μείωση των χασμάτων Ανασυνδυασμένο DNA 75Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2007 ΠΙΝΑΚΑΣ 11.2: ΠΙΝΑΚΑΣ 11.2: Η ολοκληρωμένη αλληλουχία του ανθρώπινου γονιδιώματος του IHGSC είναι σημαντικά βελτιωμένη σε σχέση με την πρόχειρη αλληλουχία.

76 Η έμφαση στην ακρίβεια άξιζε τα λεφτά της; Οι ανακρίβειες θα καθιστούσαν δύσκολο τον εντοπισμό γονιδίων Οι ανακρίβειες θα καθιστούσαν δύσκολο τον εντοπισμό γονιδίων Αν η συχνότητα σφάλματος ήταν μεγαλύτερη των SNPs (~1/1000) δεν θα μπορούσαμε να τα διακρίνουμε Αν η συχνότητα σφάλματος ήταν μεγαλύτερη των SNPs (~1/1000) δεν θα μπορούσαμε να τα διακρίνουμε Οι ανακρίβειες θα καθιστούσαν δύσκολες τις συγκρίσεις με άλλους οργανισμούς Οι ανακρίβειες θα καθιστούσαν δύσκολες τις συγκρίσεις με άλλους οργανισμούς Η ακρίβεια είναι απαραίτητη για τη διάκριση διπλασιασμένων γονιδίων και μελών μεγάλων οικογενειών γονιδίων Η ακρίβεια είναι απαραίτητη για τη διάκριση διπλασιασμένων γονιδίων και μελών μεγάλων οικογενειών γονιδίων 76

77 Τίνος το DNA; IHGSC IHGSC Ανώνυμοι δότες, αδυναμία ταυτοποίησής τους Ανώνυμοι δότες, αδυναμία ταυτοποίησής τους Καταστροφή στοιχείων των δοτών Καταστροφή στοιχείων των δοτών 70% από ένα δείγμα, 30% από άλλα ανώνυμα άτομα 70% από ένα δείγμα, 30% από άλλα ανώνυμα άτομα Celera Celera 21 δείγματα από 5 διαφορετικές φυλές → χρήσιμες πληροφορίες περί ποικιλομορφίας 21 δείγματα από 5 διαφορετικές φυλές → χρήσιμες πληροφορίες περί ποικιλομορφίας Ανωνυμία δοτών Ανωνυμία δοτών Όμως… Όμως… Ανασυνδυασμένο DNA 77Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2007

78 Ανασυνδυασμένο DNA 78Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2007

79 Ο Venter ομολόγησε ότι είχε παραβιάσει τη διαδικασία επιλογής Ο Venter ομολόγησε ότι είχε παραβιάσει τη διαδικασία επιλογής Το 2002 το συμβούλιο βιοηθικής της Celera τον απέλυσε Το 2002 το συμβούλιο βιοηθικής της Celera τον απέλυσε Στη βιογραφία του αναφέρεται ότι ο Venter ήταν έτοιμος να φύγει από τη Celera και ότι απολύθηκε λόγω αντιπαλότητας με τον βασικό χρηματοδότη, Tony White. Στη βιογραφία του αναφέρεται ότι ο Venter ήταν έτοιμος να φύγει από τη Celera και ότι απολύθηκε λόγω αντιπαλότητας με τον βασικό χρηματοδότη, Tony White. Ο Venter ισχυρίζεται ότι η βασική του επιδίωξη ήταν η «επιτάχυνση» της επιστήμης και ότι κατέφευγε σε ιδιωτικές χρηματοδοτήσεις μόνο όταν δεν μπορούσε να βρει χρήματα από δημόσιες πηγές να χρηματοδοτήσει τις ιδέες του. Ο Venter ισχυρίζεται ότι η βασική του επιδίωξη ήταν η «επιτάχυνση» της επιστήμης και ότι κατέφευγε σε ιδιωτικές χρηματοδοτήσεις μόνο όταν δεν μπορούσε να βρει χρήματα από δημόσιες πηγές να χρηματοδοτήσει τις ιδέες του. Ανασυνδυασμένο DNA 79Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2007

80  Τι να διαβάσετε ◦ Brown, Κεφάλαιο 4 ◦ Watson, Κεφάλαιο 10 80


Κατέβασμα ppt "1 Ανάλυση της αλληλουχίας των γονιδιωμάτων. Μέθοδος συνεχών κλώνων / Συναρμολόγηση χαρτογραφημένων τμημάτων Αλληλούχηση τυχαίων τμημάτων ολικού γονιδιώματος."

Παρόμοιες παρουσιάσεις


Διαφημίσεις Google