Η παρουσίαση φορτώνεται. Παρακαλείστε να περιμένετε

Η παρουσίαση φορτώνεται. Παρακαλείστε να περιμένετε

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΙΩΑΝΝΙΝΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΚΑΙ ΕΚΚΡΙΣΗΣ sPLA 2 -IIA ΣΕ ΠΝΕΥΜΟΝΟΚΥΤΤΑΡΑ ΤΥΠΟΥ II ΜΕΤΑ ΑΠΟ.

Παρόμοιες παρουσιάσεις


Παρουσίαση με θέμα: "ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΙΩΑΝΝΙΝΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΚΑΙ ΕΚΚΡΙΣΗΣ sPLA 2 -IIA ΣΕ ΠΝΕΥΜΟΝΟΚΥΤΤΑΡΑ ΤΥΠΟΥ II ΜΕΤΑ ΑΠΟ."— Μεταγράφημα παρουσίασης:

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΙΩΑΝΝΙΝΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΚΑΙ ΕΚΚΡΙΣΗΣ sPLA 2 -IIA ΣΕ ΠΝΕΥΜΟΝΟΚΥΤΤΑΡΑ ΤΥΠΟΥ II ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΕΠΙΔΡΑΣΗ LPS Κ ΑΡΑΓΙΑΝΝΟΠΟΥΛΟΣ Μ ΙΧΑΛΗΣ Χημικός, Μεταπτυχιακός Φοιτητής Βιοχημείας και Κλινικής Χημείας

2 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ 1.Ορισμός και μοντέλα σήψης, Κυτοκίνες στη σήψη 2.Μοντέλα έκκρισης - Φωσφολιπάση Α 2 3.Εργαστηριακές τεχνικές ανίχνευσης και προσδιορισμού sPLA 2 -IIA ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ - ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΚΑΙ ΕΚΚΡΙΣΗΣ sPLA 2 - IIA ΣΕ ΠΝΕΥΜΟΝΟΚΥΤΤΑΡΑ ΤΥΠΟΥ II ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΕΠΙΔΡΑΣΗ LPS

3 ΣΗΨΗ: Πολύπλοκο κλινικό σύνδρομο που χαρακτηρίζεται από συστημική φλεγμονώδη απόκριση (SIRS) σε συνδυασμό με τοπική ή συστημική λοίμωξη. SIRSΛΟΙΜΩΞΗΣΗΨΗ Σύνδρομο Συστημικής Φλεγμονώδους Απόκρισης (SIRS): Είναι μια συστημική φλεγμονώδης απόκριση σε ποικιλία σοβαρών κλινικών βλαβών (π.χ. οξεία παγκρεατίτιδα, πολλαπλούν τραύμα, εισρόφηση, έγκαυμα). Λοίμωξη: Είναι μια φλεγμονώδης απόκριση, που οφείλεται στην παρουσία κάποιου μικροοργανισμού. ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ - ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ

4 Μοντέλο σήψης: LPS Βακτηριακός Λιποπολυσακχαρίτης. Βρίσκεται σε αφθονία στο εξωτερικό περίβλημα των αρνητικών κατά Gram βακτηρίων. Λιπίδιο Α: Φωσφολιπίδιο που προκαλεί την παραγωγή φλεγμονωδών μεσολαβητών. Αποτελεί το ενεργό τμήμα του LPS. Εσωτερικός πυρήνας ολιγοσακχαρίτη: Συνδέεται με το Λιπίδιο Α και λαμβάνει μέρος στην ανάπτυξη αντίστασης σε υδρόφοβα αντιμικροβιακά πεπτίδια. Εξωτερική περιοχή Ο-πολυσακχαρίτη (αντιγόνου-Ο): Είναι η εξωτερική περιοχή του LPS και αποτελεί την αντιγονική περιοχή- στόχο των ανοσολογικών αποκρίσεων των ξενιστών. Πηγή: Microbiology, Gary E. Kaiser ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ - ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ

5 Έναρξη σύνθεσης κυτοκινών  Σύνδεση LPS με LBP (Lipopolysaccharide-Binding Protein).  Σχηματισμός συμπλέγματος LPS-LBP.  Σύνδεση με το μόριο του υποδοχέα CD14.  Σύνδεση με την πρωτεΐνη MD2 και τον υποδοχέα TLR4. Πηγή: Jpherveg ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ - ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ

6 Βιοσύνθεση TNF (Tumor Necrosis Factor)  Βιοσύνθεση TNF (Tumor Necrosis Factor) Αρχίζει η σύνθεση του TNF από την μεταγραφή του γονιδίου TNF και από τη μετάφραση του TNFmRNA. Φάση του καταρράκτη στη σήψη  Φάση του καταρράκτη στη σήψη Με την έκκριση του TNF ενεργοποιείται η έκκριση δευτεροπαθών μεσολαβητών π.χ. IL-1, IL-6, IL-8. Πηγή: Invivogen ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ - ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ Παραγωγή κυτοκινών

7 Το κλειδί στη σήψη είναι οι κυτοκίνες, που είναι ανοσορρυθμιστικά πεπτίδια παραγόμενα από τον ξενιστή. Κυτοκίνες:  Φλεγμονώδεις: TNFa, Φωσφολιπάση Α 2, IL-1β, IL-2, IL-6, IL-8, IL- 15, IFN-γ, πρωτεινική κινάση, CD14, κ.λ.π  Αντι-φλεγμονώδεις: IL-1a, IL-4, IL-10, IL-13, ο υποδοχέας της IL-1 τύπου ΙΙ, κ.λ.π. ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ - ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ

8 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ 1.Ορισμός και μοντέλα σήψης, Κυτοκίνες στη σήψη 2.Μοντέλα έκκρισης - Φωσφολιπάση Α 2 3.Εργαστηριακές τεχνικές ανίχνευσης και προσδιορισμού sPLA 2 -IIA ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ - ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΚΑΙ ΕΚΚΡΙΣΗΣ sPLA 2 - IIA ΣΕ ΠΝΕΥΜΟΝΟΚΥΤΤΑΡΑ ΤΥΠΟΥ II ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΕΠΙΔΡΑΣΗ LPS

9 Εκκριτικά Μονοπάτια Rough ER Membrane receptor Membrane cargo Soluble cargo SNARE protein SNARE pair COPII vesicle COPI vesicl e SNARE pair Cis-Golgi network Coat protein 1 Πηγή: Molecular Cell Biology, Darnell ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ - ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ

10 Τελευταίο στάδιο της εκκριτικής πορείας: Εξωκύτωση Ιδιοσύστατη Οδός Εξωκύτωσης (Constitutive Secretory Pathway): Ιδιοσύστατη Οδός Εξωκύτωσης (Constitutive Secretory Pathway): Κυστίδια μεταφοράς εκβλασταίνουν διαρκώς από το δίκτυο trans-Golgi και συντήκονται με την κυτταρική μεμβράνη. Ρυθμιζόμενη Οδός Εξωκύτωσης (Regulated Secretory Pathway): Ρυθμιζόμενη Οδός Εξωκύτωσης (Regulated Secretory Pathway): Μόρια αποθηκευμένα σε εκκριτικά κυστίδια απελευθερώνονται από το κύτταρο μετά από κατάλληλο ερέθισμα. Ορμόνες, Νευροδιαβιβαστές, Πεπτικά ένζυμα Πηγή: Molecular Biology of the Cell, Alberts ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ - ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ

11 Φωσφολιπάση Α 2 : ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ - ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ

12 Με βάση τις βιολογικές ιδιότητες και την τοπολογία, κατανέμονται σε:  Εκκρινόμενες φωσφολιπάσες Α 2 (secretory phospholipases, sPLA 2 ),  Κυτοσολικές φωσφολιπάσες Α 2 εξαρτώμενες από ιόντα ασβεστίου (cytosolic phospholipases, cPLA 2 ),  Ενδοκυττάριες ανεξάρτητες ιόντων ασβεστίου (intracellular phospholipases, iPLA 2 ),  PAF- ακετυλυδρολάσες (PAF-acetylhydrolases, PAF-AcH). ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ - ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ

13 Εκκρινόμενη Φωσφολιπάση Α 2 (Secretory Phospholipase A 2 -sPLA 2 ): Είναι μικρές, υδατοδιαλυτές πρωτεΐνες μεγέθους kDα, αποτελούμενες από μία πολυπεπτιδική αλυσίδα που περιέχει 5-8 δισουλφιδικούς δεσμούς. Τριτοταγή δομή, η οποία παρέχει στα ένζυμα αυτά σταθερότητα κατά της πρωτεόλυσης και αντίσταση στη μετουσίωση. Λαμβάνουν μέρος σε μια πληθώρα παθολογικών διαδικασιών μέσω απελευθέρωσης αραχιδονικού οξέος οδηγώντας έτσι στην παραγωγή φλεγμονωδών λιπιδικών μεσολαβητών όπως προσταγλανδίνες, θρομβοξάνια και λευκοτριένια. ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ - ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ

14 ΟμάδαΠηγήΜοριακή μάζα (kDa) IA Κόμπρα13-15 IB Άνθρωπος/πάγκρεας χοίρου13-15 IIA Κροταλίας/Ανθρώπινο αρθρικό υγρό/Δηλητήριο κόμπρας13-15 IIB Οχιά13-15 IIC Αρουραίος/όρχεις ποντικού15 IID Άνθρωπος/πάγκρεας, σπλήνα ποντικού14-15 IIE Άνθρωπος/εγκέφαλος ποντικού14-15 IIF Άνθρωπος/όρχεις ποντικού16-17 III Άνθρωπος/ποντικός/σαύρα /μέλισσα15-18 V Άνθρωπος/ποντικός14 IX Σαλιγκάρι14 X Άνθρωπος14 XIA Βλαστοί πράσινου ρυζιού12.4 XIB Βλαστοί πράσινου ρυζιού12.9 ΧΙΙ Άνθρωπος/ποντικός19 XIII Parvovirus<10 XIV Βακτήρια13-19 ΤΑΞΙΝΟΜΗΣΗ ΕΚΚΡΙΝΟΜΕΝΩΝ ΦΩΣΦΟΛΙΠΑΣΩΝ Α 2

15 sPLA 2 -IIA  Ένζυμο εξαρτώμενο από ιόντα Ca 2+.  Η αλληλουχία αμινοξέων της ανθρώπινης πρωτεΐνης αποτελείται από 124 αμινοξέα.  Έχει εμπλακεί σε φλεγμονώδεις νόσους, σηπτική καταπληξία και Σύνδρομο Οξείας Αναπνευστικής Δυσχέρειας ενηλίκων (ARDS).  Τα επίπεδα της sPLA 2 -IIA που ανιχνεύθηκαν σε BAL Fluid ή κύτταρα θεωρήθηκαν ως δείκτης για τη διάσπαση του επιφανειοδραστικού παράγοντα και συσχέτιση με την εν εξελίξει φλεγμονή. ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ - ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ

16 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ 1.Ορισμός και μοντέλα σήψης, Κυτοκίνες στη σήψη 2.Μοντέλα έκκρισης - Φωσφολιπάση Α 2 3.Εργαστηριακές τεχνικές ανίχνευσης και προσδιορισμού sPLA 2 -IIA ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ - ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΚΑΙ ΕΚΚΡΙΣΗΣ sPLA 2 - IIA ΣΕ ΠΝΕΥΜΟΝΟΚΥΤΤΑΡΑ ΤΥΠΟΥ II ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΕΠΙΔΡΑΣΗ LPS

17 Απομόνωση και επεξεργασία του BAL για εργαστηριακές αναλύσεις ΚΥΤΤΑΡΑ 1.Βακτηριοστατικό φίλτρο rpm, 10 min BAL ΜΕΤΡΗΣΗ ΚΥΤΤΑΡΩΝ 1x10 6 cells / τρυβλίο 1.Lysis Buffer rpm, 10 min BAL FLUID 1.Έλεγχος Προσκόλλησης 2.Προσθήκη Ενεργοποιητών / Αναστολέων Μετά από 4 h. Συλλογή με scrapper 1.Πρωτεΐνη (Bradford) 2.SDS-PAGE 3.2-D Electrophoresis 4.sPLA 2 -IIA (Western Blotting) 5.Confocal Microscopy LPS ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ - ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ

18 Sodium Dodecyl Sulfate-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis: SDS-PAGE Η μετακίνηση των συμπλόκων SDS- πολυπεπτιδίων εξαρτάται μόνο από το μέγεθός τους και επιτυγχάνεται με την εφαρμογή ηλεκτρικού ρεύματος μεταξύ των ηλεκτροδίων. Πηγή: Bioinformatics ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ - ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ

19 Ανοσοαποτύπωση πρωτεϊνών – Western Blotting Πηγή: Bio-Rad LaboratoriesΠηγή: GenScript Μέθοδος μεταφοράς πρωτεϊνών από gel σε μεμβράνη PVDF για την ανίχνευση της παρουσίας, σχετικής ποσότητας και μοριακού βάρους μιας συγκεκριμένης πρωτεΐνης. Για την ανίχνευση μιας συγκεκριμένης πρωτεΐνης, είναι απαραίτητη η χρήση ανοσοχημικών μεθόδων. ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ - ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ

20 Ηλεκτροφόρηση Διπλής Διάστασης – Two Dimensional Electrophoresis (2- DE) Πηγή: Arabidopsis seed proteome 1 η Διάσταση ΙΣΟΗΛΕΚΤΡΙΚΟ ΣΗΜΕΙΟ 2 η Διάσταση ΜΟΡΙΑΚΟ ΒΑΡΟΣ Πηγή: GE Healthcare IPG strips SDS-PAGE Χρώση του gel Coomassie blue G-250 Colloidal Coomassie Silver Nitrate Πηγή: Mollecular and cellural proteomics ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ - ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ

21 Συνεστιακή Μικροσκοπία Σάρωσης Laser - Confocal Laser Scanning Microscopy Παράγει με τη μορφή κηλίδων, ξεκάθαρες εικόνες σε αδιαπέραστα από την όραση δείγματα, σε ποικίλα επίπεδα. Και ο φωτισμός και η παρατήρηση είναι περιορισμένα σε ένα σημείο του παρασκευάσματος. Πραγματοποιείται ανίχνευση και στις τρεις διαστάσεις x, y, z. Πηγή: Δίκτυο Οριζόντιων Εργαστηρίων Πανεπιστημίου Ιωαννίνων ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ - ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ

22 Department of Chemistry Ευχαριστώ για την προσοχή σας!


Κατέβασμα ppt "ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΙΩΑΝΝΙΝΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΚΑΙ ΕΚΚΡΙΣΗΣ sPLA 2 -IIA ΣΕ ΠΝΕΥΜΟΝΟΚΥΤΤΑΡΑ ΤΥΠΟΥ II ΜΕΤΑ ΑΠΟ."

Παρόμοιες παρουσιάσεις


Διαφημίσεις Google