ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΙΩΑΝΝΙΝΩΝ ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ

Παρουσίαση με θέμα: "ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΙΩΑΝΝΙΝΩΝ ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ"— Μεταγράφημα παρουσίασης:

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΙΩΑΝΝΙΝΩΝ ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ
ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΚΑΙ ΕΚΚΡΙΣΗΣ sPLA2-IIA ΣΕ ΠΝΕΥΜΟΝΟΚΥΤΤΑΡΑ ΤΥΠΟΥ II ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΕΠΙΔΡΑΣΗ LPS ΚΑΡΑΓΙΑΝΝΟΠΟΥΛΟΣ ΜΙΧΑΛΗΣ Χημικός, Μεταπτυχιακός Φοιτητής Βιοχημείας και Κλινικής Χημείας

2 ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ - ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ
ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΚΑΙ ΕΚΚΡΙΣΗΣ sPLA2-IIA ΣΕ ΠΝΕΥΜΟΝΟΚΥΤΤΑΡΑ ΤΥΠΟΥ II ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΕΠΙΔΡΑΣΗ LPS ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Ορισμός και μοντέλα σήψης, Κυτοκίνες στη σήψη Μοντέλα έκκρισης - Φωσφολιπάση Α2 Εργαστηριακές τεχνικές ανίχνευσης και προσδιορισμού sPLA2-IIA ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ - ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ

3 ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ - ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ
Σύνδρομο Συστημικής Φλεγμονώδους Απόκρισης (SIRS): Είναι μια συστημική φλεγμονώδης απόκριση σε ποικιλία σοβαρών κλινικών βλαβών (π.χ. οξεία παγκρεατίτιδα, πολλαπλούν τραύμα, εισρόφηση, έγκαυμα). Λοίμωξη: Είναι μια φλεγμονώδης απόκριση, που οφείλεται στην παρουσία κάποιου μικροοργανισμού. SIRS ΛΟΙΜΩΞΗ ΣΗΨΗ ΣΗΨΗ: Πολύπλοκο κλινικό σύνδρομο που χαρακτηρίζεται από συστημική φλεγμονώδη απόκριση (SIRS) σε συνδυασμό με τοπική ή συστημική λοίμωξη. ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ - ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ

4 ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ - ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ
Μοντέλο σήψης: LPS Βακτηριακός Λιποπολυσακχαρίτης. Βρίσκεται σε αφθονία στο εξωτερικό περίβλημα των αρνητικών κατά Gram βακτηρίων. Πηγή: Microbiology, Gary E. Kaiser Λιπίδιο Α: Φωσφολιπίδιο που προκαλεί την παραγωγή φλεγμονωδών μεσολαβητών. Αποτελεί το ενεργό τμήμα του LPS. Εσωτερικός πυρήνας ολιγοσακχαρίτη: Συνδέεται με το Λιπίδιο Α και λαμβάνει μέρος στην ανάπτυξη αντίστασης σε υδρόφοβα αντιμικροβιακά πεπτίδια. Εξωτερική περιοχή Ο-πολυσακχαρίτη (αντιγόνου-Ο): Είναι η εξωτερική περιοχή του LPS και αποτελεί την αντιγονική περιοχή-στόχο των ανοσολογικών αποκρίσεων των ξενιστών. ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ - ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ

5 ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ - ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ
Έναρξη σύνθεσης κυτοκινών Σύνδεση LPS με LBP (Lipopolysaccharide-Binding Protein). Σχηματισμός συμπλέγματος LPS-LBP. Σύνδεση με το μόριο του υποδοχέα CD14. Σύνδεση με την πρωτεΐνη MD2 και τον υποδοχέα TLR4. Πηγή: Jpherveg ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ - ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ

6 ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ - ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ
Παραγωγή κυτοκινών Βιοσύνθεση TNF (Tumor Necrosis Factor) Αρχίζει η σύνθεση του TNF από την μεταγραφή του γονιδίου TNF και από τη μετάφραση του TNFmRNA. Φάση του καταρράκτη στη σήψη Με την έκκριση του TNF ενεργοποιείται η έκκριση δευτεροπαθών μεσολαβητών π.χ. IL-1, IL-6, IL-8. Πηγή: Invivogen ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ - ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ

7 ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ - ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ
Το κλειδί στη σήψη είναι οι κυτοκίνες, που είναι ανοσορρυθμιστικά πεπτίδια παραγόμενα από τον ξενιστή. Κυτοκίνες: Φλεγμονώδεις: TNFa, Φωσφολιπάση Α2, IL-1β, IL-2, IL-6, IL-8, IL-15, IFN-γ, πρωτεινική κινάση, CD14, κ.λ.π Αντι-φλεγμονώδεις: IL-1a, IL-4, IL-10, IL-13, ο υποδοχέας της IL-1 τύπου ΙΙ, κ.λ.π. ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ - ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ

8 ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ - ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ
ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΚΑΙ ΕΚΚΡΙΣΗΣ sPLA2-IIA ΣΕ ΠΝΕΥΜΟΝΟΚΥΤΤΑΡΑ ΤΥΠΟΥ II ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΕΠΙΔΡΑΣΗ LPS ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Ορισμός και μοντέλα σήψης, Κυτοκίνες στη σήψη Μοντέλα έκκρισης - Φωσφολιπάση Α2 Εργαστηριακές τεχνικές ανίχνευσης και προσδιορισμού sPLA2-IIA ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ - ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ

9 ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ - ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ
Εκκριτικά Μονοπάτια Rough ER Membrane receptor Membrane cargo Soluble cargo SNARE protein SNARE pair COPII vesicle COPI vesicle Cis-Golgi network Coat protein 1 Πηγή: Molecular Cell Biology, Darnell ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ - ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ

10 Τελευταίο στάδιο της εκκριτικής πορείας: Εξωκύτωση
Ιδιοσύστατη Οδός Εξωκύτωσης (Constitutive Secretory Pathway): Κυστίδια μεταφοράς εκβλασταίνουν διαρκώς από το δίκτυο trans-Golgi και συντήκονται με την κυτταρική μεμβράνη. Ρυθμιζόμενη Οδός Εξωκύτωσης (Regulated Secretory Pathway): Μόρια αποθηκευμένα σε εκκριτικά κυστίδια απελευθερώνονται από το κύτταρο μετά από κατάλληλο ερέθισμα. Πηγή: Molecular Biology of the Cell, Alberts Ορμόνες, Νευροδιαβιβαστές, Πεπτικά ένζυμα ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ - ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ

11 ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ - ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ
Φωσφολιπάση Α2: ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ - ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ

12 ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ - ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ
Με βάση τις βιολογικές ιδιότητες και την τοπολογία, κατανέμονται σε: Εκκρινόμενες φωσφολιπάσες Α2 (secretory phospholipases, sPLA2), Κυτοσολικές φωσφολιπάσες Α2 εξαρτώμενες από ιόντα ασβεστίου (cytosolic phospholipases, cPLA2), Ενδοκυττάριες ανεξάρτητες ιόντων ασβεστίου (intracellular phospholipases, iPLA2), PAF- ακετυλυδρολάσες (PAF-acetylhydrolases, PAF-AcH). ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ - ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ

13 ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ - ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ
Εκκρινόμενη Φωσφολιπάση Α2 (Secretory Phospholipase A2-sPLA2): Είναι μικρές, υδατοδιαλυτές πρωτεΐνες μεγέθους kDα, αποτελούμενες από μία πολυπεπτιδική αλυσίδα που περιέχει 5-8 δισουλφιδικούς δεσμούς. Τριτοταγή δομή, η οποία παρέχει στα ένζυμα αυτά σταθερότητα κατά της πρωτεόλυσης και αντίσταση στη μετουσίωση. Λαμβάνουν μέρος σε μια πληθώρα παθολογικών διαδικασιών μέσω απελευθέρωσης αραχιδονικού οξέος οδηγώντας έτσι στην παραγωγή φλεγμονωδών λιπιδικών μεσολαβητών όπως προσταγλανδίνες, θρομβοξάνια και λευκοτριένια. ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ - ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ

14 ΤΑΞΙΝΟΜΗΣΗ ΕΚΚΡΙΝΟΜΕΝΩΝ ΦΩΣΦΟΛΙΠΑΣΩΝ Α2
Ομάδα Πηγή Μοριακή μάζα (kDa) IA Κόμπρα 13-15 IB Άνθρωπος/πάγκρεας χοίρου IIA Κροταλίας/Ανθρώπινο αρθρικό υγρό/Δηλητήριο κόμπρας IIB Οχιά IIC Αρουραίος/όρχεις ποντικού 15 IID Άνθρωπος/πάγκρεας, σπλήνα ποντικού 14-15 IIE Άνθρωπος/εγκέφαλος ποντικού IIF Άνθρωπος/όρχεις ποντικού 16-17 III Άνθρωπος/ποντικός/σαύρα /μέλισσα 15-18 V Άνθρωπος/ποντικός 14 IX Σαλιγκάρι X Άνθρωπος XIA Βλαστοί πράσινου ρυζιού 12.4 XIB 12.9 ΧΙΙ 19 XIII Parvovirus <10 XIV Βακτήρια 13-19

15 ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ - ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ
sPLA2-IIA Ένζυμο εξαρτώμενο από ιόντα Ca2+. Η αλληλουχία αμινοξέων της ανθρώπινης πρωτεΐνης αποτελείται από 124 αμινοξέα. Έχει εμπλακεί σε φλεγμονώδεις νόσους, σηπτική καταπληξία και Σύνδρομο Οξείας Αναπνευστικής Δυσχέρειας ενηλίκων (ARDS). Τα επίπεδα της sPLA2-IIA που ανιχνεύθηκαν σε BAL Fluid ή κύτταρα θεωρήθηκαν ως δείκτης για τη διάσπαση του επιφανειοδραστικού παράγοντα και συσχέτιση με την εν εξελίξει φλεγμονή. ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ - ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ

16 ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ - ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ
ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΚΑΙ ΕΚΚΡΙΣΗΣ sPLA2-IIA ΣΕ ΠΝΕΥΜΟΝΟΚΥΤΤΑΡΑ ΤΥΠΟΥ II ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΕΠΙΔΡΑΣΗ LPS ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Ορισμός και μοντέλα σήψης, Κυτοκίνες στη σήψη Μοντέλα έκκρισης - Φωσφολιπάση Α2 Εργαστηριακές τεχνικές ανίχνευσης και προσδιορισμού sPLA2-IIA ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ - ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ

17 ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ - ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ
Απομόνωση και επεξεργασία του BAL για εργαστηριακές αναλύσεις ΚΥΤΤΑΡΑ Βακτηριοστατικό φίλτρο 2000 rpm, 10 min BAL ΜΕΤΡΗΣΗ ΚΥΤΤΑΡΩΝ 1x106 cells / τρυβλίο Lysis Buffer BAL FLUID Έλεγχος Προσκόλλησης Προσθήκη Ενεργοποιητών / Αναστολέων Μετά από 4 h. Συλλογή με scrapper Πρωτεΐνη (Bradford) SDS-PAGE 2-D Electrophoresis sPLA2-IIA (Western Blotting) Confocal Microscopy LPS ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ - ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ

18 ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ - ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ
Sodium Dodecyl Sulfate-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis: SDS-PAGE Η μετακίνηση των συμπλόκων SDS-πολυπεπτιδίων εξαρτάται μόνο από το μέγεθός τους και επιτυγχάνεται με την εφαρμογή ηλεκτρικού ρεύματος μεταξύ των ηλεκτροδίων. Πηγή: Bioinformatics Πηγή: Bioinformatics ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ - ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ

19 ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ - ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ
Ανοσοαποτύπωση πρωτεϊνών – Western Blotting Πηγή: Bio-Rad Laboratories Πηγή: GenScript Μέθοδος μεταφοράς πρωτεϊνών από gel σε μεμβράνη PVDF για την ανίχνευση της παρουσίας, σχετικής ποσότητας και μοριακού βάρους μιας συγκεκριμένης πρωτεΐνης. Για την ανίχνευση μιας συγκεκριμένης πρωτεΐνης, είναι απαραίτητη η χρήση ανοσοχημικών μεθόδων. ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ - ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ

20 ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ - ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ
Ηλεκτροφόρηση Διπλής Διάστασης – Two Dimensional Electrophoresis (2-DE) Πηγή: Mollecular and cellural proteomics Πηγή: Arabidopsis seed proteome 1η Διάσταση ΙΣΟΗΛΕΚΤΡΙΚΟ ΣΗΜΕΙΟ 2η Διάσταση ΜΟΡΙΑΚΟ ΒΑΡΟΣ Χρώση του gel Coomassie blue G-250 Colloidal Coomassie Silver Nitrate Πηγή: GE Healthcare IPG strips SDS-PAGE ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ - ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ

21 ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ - ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ
Συνεστιακή Μικροσκοπία Σάρωσης Laser - Confocal Laser Scanning Microscopy Πηγή: Δίκτυο Οριζόντιων Εργαστηρίων Πανεπιστημίου Ιωαννίνων Παράγει με τη μορφή κηλίδων, ξεκάθαρες εικόνες σε αδιαπέραστα από την όραση δείγματα, σε ποικίλα επίπεδα. Και ο φωτισμός και η παρατήρηση είναι περιορισμένα σε ένα σημείο του παρασκευάσματος. Πραγματοποιείται ανίχνευση και στις τρεις διαστάσεις x, y, z. ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ - ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ

22 Ευχαριστώ για την προσοχή σας!
Department of Chemistry Ευχαριστώ για την προσοχή σας!