Η παρουσίαση φορτώνεται. Παρακαλείστε να περιμένετε

Η παρουσίαση φορτώνεται. Παρακαλείστε να περιμένετε

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΙΩΑΝΝΙΝΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ ΑΘΑΝΑΣΙΟΣ ΚΑΡΚΑΜΠΟΥΝΑΣ MSc ΧΗΜΙΚΟΣ ΜΕΘΟΔΟΙ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥ ΕΝΕΡΓΟΤΗΤΑΣ ΦΩΣΦΟΛΙΠΑΣΗΣ.

Παρόμοιες παρουσιάσεις


Παρουσίαση με θέμα: "ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΙΩΑΝΝΙΝΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ ΑΘΑΝΑΣΙΟΣ ΚΑΡΚΑΜΠΟΥΝΑΣ MSc ΧΗΜΙΚΟΣ ΜΕΘΟΔΟΙ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥ ΕΝΕΡΓΟΤΗΤΑΣ ΦΩΣΦΟΛΙΠΑΣΗΣ."— Μεταγράφημα παρουσίασης:

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΙΩΑΝΝΙΝΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ ΑΘΑΝΑΣΙΟΣ ΚΑΡΚΑΜΠΟΥΝΑΣ MSc ΧΗΜΙΚΟΣ ΜΕΘΟΔΟΙ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥ ΕΝΕΡΓΟΤΗΤΑΣ ΦΩΣΦΟΛΙΠΑΣΗΣ Α 2 (PLA 2 ) ΣΤΟ BAL

2 1. Μέθοδοι Προσδιορισμού PLA 2 2. Φθορισμομετρική μέθοδος προσδιορισμού PLA 2 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΜΕΘΟΔΟΙ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥ ΕΝΕΡΓΟΤΗΤΑΣ ΦΩΣΦΟΛΙΠΑΣΗΣ Α 2 (PLA 2 ) ΣΤΟ BAL

3 ΦΩΣΦΟΛΙΠΑΣΕΣ Α 2 (PLA 2 ) Υδρολύουν εστερικούς δεσμούς στη θέση sn-2 των φωσφολιπιδίων Παράγονται ελεύθερα λιπαρά οξέα λυσο φωσφολιπίδια

4 Μέθοδοι Όριο ανίχνευσης Ογκομετρικές 20 nmol pHμετρικές 100 pmol Ραδιομετρικές 1 fmol-1 pmol NMR 1 μmol Πολαρογραφικές 40 nmol Φασματοφωτομετρικές 200 pmol-25 nmol Φθορισμομετρικές 1 pmol ESR 1 nmol Συνδυασμοί με Χρωματογραφικές <1 pmol ΚΥΡΙΟΤΕΡΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥ PLA 2

5 ΡΑΔΙΟΜΕΤΡΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ Απαιτούν τη χρήση υποστρωμάτων σημασμένων με ραδιενεργά ισότοπα Πλεονεκτήματα: ευαισθησία επαναληψιμότητα χαμηλό όριο ανίχνευσης Μειονεκτήματα: μεγάλος χρόνος ανάλυσης ασυνεχείς επιβλαβείς χημικές ουσίες

6 ΦΘΟΡΙΣΜΟΜΕΤΡΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ Ανάπτυξη υποστρωμάτων και λιπαρών οξέων σημασμένων με φθορίζουσες ομάδες Πλεονεκτήματα: γραμμικότητα επαναληψιμότητα χαμηλό όριο ανίχνευσης κόστος ανάλυσης Μειονεκτήματα: περιορισμοί του φαινομένου του φθορισμού ασυνεχείς

7 ΦΘΟΡΙΣΜΟΜΕΤΡΙΚΗ ΜΕΘΟΔΟΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥ PLA 2 Χρήση C 12 -NBD-PC Απελευθέρωση C 12 -NBD-FA

8 PLA 2 NBD ΑΡΧΗ ΜΕΘΟΔΟΥ

9 ΔΡΑΣΗ ΤΗΣ PLA 2 ΣΤΗΝ C 12 -NBD-PC C 12 -NBD-PC PLA 2 C 12 -NBD-FA

10  Φασματοφθορισμόμετρο ΟΡΓΑΝΑ

11 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΠΟΡΕΙΑ Ρυθμιστικό διάλυμα Υπόστρωμα της C 12 -NBD-PC BAL, θετικό control (πρότυπη PLA 2 ), αρνητικό control (ίδιο δείγμα BAL βρασμένο) Καταγραφή της μεταβολής της έντασης του φθορισμού συναρτήσει του χρόνου σε λ ex =475 nm και λ em =535 nm Πρότυπο διάλυμα C 12 -NBD-FA

12 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ AΕνεργότητα PLA 2 (nmol FA/h/mL BAL λΚλίση ευθείας ΔFΔF αύξηση έντασης φθορισμού VΌγκος BAL (μL)

13 ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΜΕΘΟΔΟΥ Πλεονεκτήματα Γραμμική (50 pmol-200 nmol) Χαμηλό όριο ανίχνευσης (< 1pmol) Ικανοποιητική επαναληψιμότητα Περιορισμοί Δείγματα BAL με υψηλή συγκέντρωση ολικής πρωτεΐνης

14 HPLC-ΦΘΟΡΙΣΜΟΜΕΤΡΙΚΗ ΜΕΘΟΔΟΣ Διαχωρισμό της C 12 -NBD-PC από το C 12 -NBD-FA Σύστημα Έκλουσης t R (min) C 12 -NBD-PCC 12 -NBD-FA Rs CH 3 OH-H 2 O (80:20, v/v)

15 ΟΡΓΑΝΑ Υγρός Χρωματογράφος Υψηλής Πίεσης Ανιχνευτή διόδου λυχνίας Φθορισμομετρικό ανιχνευτή

16 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΠΟΡΕΙΑ Ρυθμιστικό διάλυμα Υπόστρωμα της C 12 -NBD-PC BAL, θετικό control (πρότυπη PLA 2 ), αρνητικό control (ίδιο δείγμα BAL βρασμένο) Ένεση 20 μL στην HPLC, λ ex =475 nm και λ em =535 nm, 0.5 mL/min Καταγράφουμε τη μεταβολή του εμβαδού κορυφής του C 12 -NBD-FA συναρτήσει του χρόνου Πρότυπη καμπύλη

17 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

18 ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΜΕΘΟΔΟΥ Γραμμική για ευρεία περιοχή συγκεντρώσεων (από 1 pmol έως 250 nmol FA/h/mL BAL) Επαναλήψιμη (% RSD ≤ 13% PLA 2 ) Παρουσιάζει σημαντική στατιστική συσχέτιση με ραδιομετρική μέθοδο Εφαρμόζεται σε περιπτώσεις δειγμάτων BAL, ορού ή πλάσματος με υψηλή συγκέντρωση ολικής πρωτεΐνης


Κατέβασμα ppt "ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΙΩΑΝΝΙΝΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ ΑΘΑΝΑΣΙΟΣ ΚΑΡΚΑΜΠΟΥΝΑΣ MSc ΧΗΜΙΚΟΣ ΜΕΘΟΔΟΙ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥ ΕΝΕΡΓΟΤΗΤΑΣ ΦΩΣΦΟΛΙΠΑΣΗΣ."

Παρόμοιες παρουσιάσεις


Διαφημίσεις Google