ΜΕΘΟΔΟΙ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥ ΕΝΕΡΓΟΤΗΤΑΣ ΦΩΣΦΟΛΙΠΑΣΗΣ Α2 (PLA2) ΣΤΟ BAL

Παρουσίαση με θέμα: "ΜΕΘΟΔΟΙ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥ ΕΝΕΡΓΟΤΗΤΑΣ ΦΩΣΦΟΛΙΠΑΣΗΣ Α2 (PLA2) ΣΤΟ BAL"— Μεταγράφημα παρουσίασης:

1 ΜΕΘΟΔΟΙ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥ ΕΝΕΡΓΟΤΗΤΑΣ ΦΩΣΦΟΛΙΠΑΣΗΣ Α2 (PLA2) ΣΤΟ BAL
ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΙΩΑΝΝΙΝΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ ΜΕΘΟΔΟΙ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥ ΕΝΕΡΓΟΤΗΤΑΣ ΦΩΣΦΟΛΙΠΑΣΗΣ Α2 (PLA2) ΣΤΟ BAL ΑΘΑΝΑΣΙΟΣ ΚΑΡΚΑΜΠΟΥΝΑΣ MSc ΧΗΜΙΚΟΣ

2 ΜΕΘΟΔΟΙ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥ ΕΝΕΡΓΟΤΗΤΑΣ ΦΩΣΦΟΛΙΠΑΣΗΣ Α2 (PLA2) ΣΤΟ BAL
ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ 1. Μέθοδοι Προσδιορισμού PLA2 2. Φθορισμομετρική μέθοδος προσδιορισμού PLA2

3 ΦΩΣΦΟΛΙΠΑΣΕΣ Α2 (PLA2) Υδρολύουν
εστερικούς δεσμούς στη θέση sn-2 των φωσφολιπιδίων Παράγονται ελεύθερα λιπαρά οξέα λυσο φωσφολιπίδια

4 ΚΥΡΙΟΤΕΡΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥ PLA2
Μέθοδοι Όριο ανίχνευσης Ογκομετρικές nmol pHμετρικές pmol Ραδιομετρικές fmol-1 pmol NMR μmol Πολαρογραφικές nmol Φασματοφωτομετρικές pmol-25 nmol Φθορισμομετρικές pmol ESR nmol Συνδυασμοί με Χρωματογραφικές <1 pmol

5 ΡΑΔΙΟΜΕΤΡΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ
Απαιτούν τη χρήση υποστρωμάτων σημασμένων με ραδιενεργά ισότοπα Πλεονεκτήματα: ευαισθησία επαναληψιμότητα χαμηλό όριο ανίχνευσης Μειονεκτήματα: μεγάλος χρόνος ανάλυσης ασυνεχείς επιβλαβείς χημικές ουσίες

6 ΦΘΟΡΙΣΜΟΜΕΤΡΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ
Ανάπτυξη υποστρωμάτων και λιπαρών οξέων σημασμένων με φθορίζουσες ομάδες Πλεονεκτήματα: γραμμικότητα επαναληψιμότητα χαμηλό όριο ανίχνευσης κόστος ανάλυσης Μειονεκτήματα: περιορισμοί του φαινομένου του φθορισμού ασυνεχείς

7 ΦΘΟΡΙΣΜΟΜΕΤΡΙΚΗ ΜΕΘΟΔΟΣ
ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥ PLA2 Χρήση C12-NBD-PC Απελευθέρωση C12-NBD-FA

8 ΑΡΧΗ ΜΕΘΟΔΟΥ NBD PLA2 PLA2 NBD NBD

9 ΔΡΑΣΗ ΤΗΣ PLA2 ΣΤΗΝ C12-NBD-PC
C12-NBD-FA C12-NBD-PC

10 ΟΡΓΑΝΑ Φασματοφθορισμόμετρο

11 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΠΟΡΕΙΑ Ρυθμιστικό διάλυμα Υπόστρωμα της C12-NBD-PC
BAL, θετικό control (πρότυπη PLA2), αρνητικό control (ίδιο δείγμα BAL βρασμένο) Καταγραφή της μεταβολής της έντασης του φθορισμού συναρτήσει του χρόνου σε λex=475 nm και λem=535 nm Πρότυπο διάλυμα C12-NBD-FA

12 αύξηση έντασης φθορισμού
ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ A Ενεργότητα PLA2 (nmol FA/h/mL BAL λ Κλίση ευθείας ΔF αύξηση έντασης φθορισμού V Όγκος BAL (μL)

13 ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΜΕΘΟΔΟΥ
Πλεονεκτήματα Γραμμική (50 pmol-200 nmol) Χαμηλό όριο ανίχνευσης (< 1pmol) Ικανοποιητική επαναληψιμότητα Περιορισμοί Δείγματα BAL με υψηλή συγκέντρωση ολικής πρωτεΐνης

14 HPLC-ΦΘΟΡΙΣΜΟΜΕΤΡΙΚΗ ΜΕΘΟΔΟΣ
Διαχωρισμό της C12-NBD-PC από το C12-NBD-FA Σύστημα Έκλουσης tR (min) C12-NBD-PC C12-NBD-FA Rs CH3OH-H2O (80:20, v/v) 6.6 11.5 4.4

15 ΟΡΓΑΝΑ Υγρός Χρωματογράφος Υψηλής Πίεσης Ανιχνευτή διόδου λυχνίας
Φθορισμομετρικό ανιχνευτή

16 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΠΟΡΕΙΑ Ρυθμιστικό διάλυμα Υπόστρωμα της C12-NBD-PC
BAL, θετικό control (πρότυπη PLA2), αρνητικό control (ίδιο δείγμα BAL βρασμένο) Ένεση 20 μL στην HPLC, λex=475 nm και λem=535 nm, 0.5 mL/min Καταγράφουμε τη μεταβολή του εμβαδού κορυφής του C12-NBD-FA συναρτήσει του χρόνου Πρότυπη καμπύλη

17 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

18 ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΜΕΘΟΔΟΥ
Γραμμική για ευρεία περιοχή συγκεντρώσεων (από 1 pmol έως 250 nmol FA/h/mL BAL) Επαναλήψιμη (% RSD ≤ 13% PLA2) Παρουσιάζει σημαντική στατιστική συσχέτιση με ραδιομετρική μέθοδο Εφαρμόζεται σε περιπτώσεις δειγμάτων BAL, ορού ή πλάσματος με υψηλή συγκέντρωση ολικής πρωτεΐνης