Η παρουσίαση φορτώνεται. Παρακαλείστε να περιμένετε

Η παρουσίαση φορτώνεται. Παρακαλείστε να περιμένετε

Polymerase Chain Reaction (PCR) Διδακτικά σχήματα 3 η Εργασία – θέμα 2 ο Μπακολίτσας Κώστας.

Παρόμοιες παρουσιάσεις


Παρουσίαση με θέμα: "Polymerase Chain Reaction (PCR) Διδακτικά σχήματα 3 η Εργασία – θέμα 2 ο Μπακολίτσας Κώστας."— Μεταγράφημα παρουσίασης:

1 Polymerase Chain Reaction (PCR) Διδακτικά σχήματα 3 η Εργασία – θέμα 2 ο Μπακολίτσας Κώστας

2 Polymerase Chain Reaction Πολυμεράση: DNA πολυμεράση Η DNA πολυμεράση αντιγράφει το DNA Πρίν ένα κύτταρο διαιρεθεί, το DNA του πρέπει να αντιγραφεί Αλυσιδωτή αντίδραση : Το προϊόν της αντίδρασης χρησιμοποιείται για να ενισχύσει την ίδια την αντίδραση Καταλήγει σε γρήγορη αύξηση των προϊόντων

3 Polymerase Chain Reaction (PCR) Η PCR επιτελεί την χημική αντιγραφή του DNA in vitro Η PCR επιτελεί την χημική αντιγραφή του DNA in vitro Πολυάριθμες PCR εφαρμογές κάνουν χρήση αυτής της διαδικασίας σε πολλά εργαστήρια βιολογίας Πολυάριθμες PCR εφαρμογές κάνουν χρήση αυτής της διαδικασίας σε πολλά εργαστήρια βιολογίας Καταλαβαίνοντας τις ιδιότητες των DNA πολυμερασών συμβάλουμε στην κατανόηση της PCR Καταλαβαίνοντας τις ιδιότητες των DNA πολυμερασών συμβάλουμε στην κατανόηση της PCR

4 Ανακάλυψη Η PCR ανακαλύφθηκε από τον Kary Mullis Η PCR ανακαλύφθηκε από τον Kary Mullis –Σε μια μακροχρόνια οδήγηση μοτοσικλέτας –Διανοητικά απεικόνισε τη διαδικασία Βραβείο Nobel στη Χημεία Βραβείο Nobel στη Χημεία –1993

5 DNA πολυμεράση Αντιγράφει DNA Αντιγράφει DNA Απαραίτητη για την αναπαραγωγή νέων κυττάρων Απαραίτητη για την αναπαραγωγή νέων κυττάρων Περισσότερες από μία DNA πολυμεράσες προερχόμενες από διαφορετικούς οργανισμούς Περισσότερες από μία DNA πολυμεράσες προερχόμενες από διαφορετικούς οργανισμούς

6 Ιδιότητες της DNA πολυμεράσης 3’ 5’ 3’ Απαιτείται ένα προϋπάρχον DNA για να αντιγραφεί Απαιτείται ένα προϋπάρχον DNA για να αντιγραφεί –Δεν μπορεί να συναρμολογήσει έναν νέο κλώνο από τα συστατικά του –Λέγεται πρότυπο DNA Μπορεί μόνο να επεκτείνει προϋπάρχοντα τμήματα DNA που Μπορεί μόνο να επεκτείνει προϋπάρχοντα τμήματα DNA που –Λέγονται εκκινητές

7 Ιδιότητες της DNA πολυμεράσης Η DNA πολυμεράση χρειάζεται Mg ++ σαν συμπαράγοντα Η DNA πολυμεράση χρειάζεται Mg ++ σαν συμπαράγοντα Κάθε DNA πολυμεράση δουλεύει καλύτερα κάτω βέλτιστη θερμοκρασία, pH και συγκέντρωση άλατος Κάθε DNA πολυμεράση δουλεύει καλύτερα κάτω βέλτιστη θερμοκρασία, pH και συγκέντρωση άλατος Το PCR ρυθμιστικό διάλυμα εξασφαλίζει βέλτιστο pH και κατάσταση αλατότητας Το PCR ρυθμιστικό διάλυμα εξασφαλίζει βέλτιστο pH και κατάσταση αλατότητας

8 Ιδιότητες της DNA πολυμεράσης Οι DNA κλώνοι είναι αντιπαράλληλοι Οι DNA κλώνοι είναι αντιπαράλληλοι –Ο ένας κλώνος είναι 5’  3’ –Ο συμπληρωματικός του είναι 3’  5’ Η DNA πολυμεράση πάντα κινείται με κατεύθυνση (από 5’  3’) Η DNA πολυμεράση πάντα κινείται με κατεύθυνση (από 5’  3’) 3’ 5’ 3’

9 Ιδιότητες της DNA πολυμεράσης Η DNA πολυμεράση ενσωματώνει τα 4 νουκλεοτίδια (A, T, G, C) στην αναπτυσσόμενη αλυσίδα Η DNA πολυμεράση ενσωματώνει τα 4 νουκλεοτίδια (A, T, G, C) στην αναπτυσσόμενη αλυσίδα Τα dNTP ακολουθούν τον πρότυπο κανόνα ένωσης των βάσεων Τα dNTP ακολουθούν τον πρότυπο κανόνα ένωσης των βάσεων 3’ 5’ 3’ dCTP dTTP dCTP dGTP dATP dGTP dCTP dTTP dATP dGTP dCTP dTTP dATP dGTPdCTPdTTPdATPdGTP dATP dGTP dTTP dATP dCTP dTTP

10 Ιδιότητες της DNA πολυμεράσης Οι πρόσφατα παραγόμενοι DNA κλώνοι λειτουργούν σαν πρότυπο DNA για τον επόμενο κύκλο Οι πρόσφατα παραγόμενοι DNA κλώνοι λειτουργούν σαν πρότυπο DNA για τον επόμενο κύκλο Η PCR είναι πολύ ευαίσθητη Η PCR είναι πολύ ευαίσθητη Ευρεία χρήση Ευρεία χρήση

11 Προετοιμάζοντας μιά PCR αντίδραση Προσθέτουμε πρότυπο DNA εκκινητές Προσθέτουμε πρότυπο DNA εκκινητές 3’ 5’ 3’ dCTP dTTP dCTP dGTP dATP dGTP dCTP dTTP dATP dGTP dCTP dTTP dATP dGTPdCTPdTTPdATPdGTP dATP dGTP dTTP dATP dCTP dTTP Προσθέτουμε dNTPs Προσθέτουμε dNTPs Προσθέτουμε DNA πολυμεράση Προσθέτουμε DNA πολυμεράση

12 Η σχεδίαση του εκκινητή μια πολύ επίπονη διαδικασία, με την οποία παράγεται ένα προϊόν : Η GC-περιεκτικότητα πρέπει να είναι μεταξύ 40-60%. Η GC-περιεκτικότητα πρέπει να είναι μεταξύ 40-60%. Η υπολογισμένη Tm και για τους δύο χρησιμοποιούμενους εκκινητές στην αντίδραση δεν πρέπει να διαφέρει περισσότερο από 5°C, και η Tm από το προϊόν ενίσχυσης δεν πρέπει να διαφέρει από τους primers περισσότερο από 10°C (Στην πράξη μπορεί να μην είναι πάντα αληθινή). Η υπολογισμένη Tm και για τους δύο χρησιμοποιούμενους εκκινητές στην αντίδραση δεν πρέπει να διαφέρει περισσότερο από 5°C, και η Tm από το προϊόν ενίσχυσης δεν πρέπει να διαφέρει από τους primers περισσότερο από 10°C (Στην πράξη μπορεί να μην είναι πάντα αληθινή). Θερμοκρασία αναδιάταξης συνήθως είναι 5°C κάτω από την υπολογισμένη χαμηλότερη Tm. Εντούτοις, πρέπει να επιλεχτεί εμπειρικά για τις ιδιαίτερες συνθήκες. Θερμοκρασία αναδιάταξης συνήθως είναι 5°C κάτω από την υπολογισμένη χαμηλότερη Tm. Εντούτοις, πρέπει να επιλεχτεί εμπειρικά για τις ιδιαίτερες συνθήκες. Πρέπει να αποφευχθεί εσωτερική αυτοσυμπληρωματική φουρκέτα από >4 και από >8 διμερή. Η σχεδίαση του 3'άκρου του εκκινητή είναι κρίσιμο στην επιτυχία της PCR από εκκινητή που επιμηκύνεται από το 3' άκρο. Το 3΄ άκρο δεν πρέπει να είναι συμπληρωματικό με περισσότερες από 3-4 βάσεις σε οποιαδήποτε περιοχή του άλλου εκκινητή (ή ακόμα και του ίδιου εκκινητή) που χρησιμοποιείται στην αντίδραση και πρέπει να παρέχει σωστό ταίριασμα βάσεων στο πρότυπο. Πρέπει να αποφευχθεί εσωτερική αυτοσυμπληρωματική φουρκέτα από >4 και από >8 διμερή. Η σχεδίαση του 3'άκρου του εκκινητή είναι κρίσιμο στην επιτυχία της PCR από εκκινητή που επιμηκύνεται από το 3' άκρο. Το 3΄ άκρο δεν πρέπει να είναι συμπληρωματικό με περισσότερες από 3-4 βάσεις σε οποιαδήποτε περιοχή του άλλου εκκινητή (ή ακόμα και του ίδιου εκκινητή) που χρησιμοποιείται στην αντίδραση και πρέπει να παρέχει σωστό ταίριασμα βάσεων στο πρότυπο.

13 Υπάρχουν προγράμματα υπολογιστών για να βοηθήσουν στον σχεδιασμό των εκκινητών

14 Αλγόριθμος για την σχεδίαση εκκινητή Εισαγωγή της έναρξης και του τερματισμού της κεντρικής περιοχής Εισαγωγή του μήκους των εκκινητών GC περιεκτικότητα 45-55% Tm: o C Φούρκες και αυτό-διμερισμός διασταυρούμενος διμερισμός Αποκλεισμένοι εκκινητές N N Y Y Y Y N N Λίστα από αποδεκτούς εκκινητές Εισαγωγή DNA αλληλουχίας

15 Taq DNA πολυμεράση Προέρχεται από το Thermus aquaticus Προέρχεται από το Thermus aquaticus Θερμοάντοχη DNA πολυμεράση Θερμοάντοχη DNA πολυμεράση Ιδανική θερμοκρασία 72 ο C Ιδανική θερμοκρασία 72 ο C

16 Thermus aquaticus Tο βακτήριοThermus aquaticus ανακαλύφθηκε αρχικά σε διάφορες θερμοπηγές στην περιοχή Great Fountain του Lower Geyser Basin στο Yellowstone National Park

17 Θερμοανθεκτικές DNA πολυμεράσες Exo- Pfu DNA Polymerase Exo- Pfu DNA Polymerase Herculase Enhanced DNA Polymerase Herculase Enhanced DNA Polymerase Pfu DNA Polymerases Pfu DNA Polymerases PfuTurbo DNA Polymerase PfuTurbo DNA Polymerase SureStart Taq DNA Polymerase SureStart Taq DNA Polymerase Taq DNA Polymerase Taq DNA Polymerase Taq2000 DNA Polymerase Taq2000 DNA Polymerase TaqPlus Long PCR System TaqPlus Long PCR System TaqPlus Precision PCR System TaqPlus Precision PCR System YieldAce DNA Polymerase YieldAce DNA Polymerase

18 Θερμική ανακύκλωση Η PCR μηχανή ελέγχει τις θερμοκρασίες Η PCR μηχανή ελέγχει τις θερμοκρασίες Η τυπική PCR πραγματοποιείται σε τρία βήματα Η τυπική PCR πραγματοποιείται σε τρία βήματα –Αποδιάταξη –Επαναδιάταξη –Επέκταση

19 Αποδιάταξη Η θέρμανση χωρίζει το δίκλωνο DNA Η θέρμανση χωρίζει το δίκλωνο DNA –Αποδιάταξη Αργή ψύξη επαναδιαττάσει τους δύο κλώνους Αργή ψύξη επαναδιαττάσει τους δύο κλώνους –Επαναδιάταξη Heat Cool

20 Επαναδιάταξη Οι δύο εκκινητές εφαρμόζονται σε μοριακή περίσσεια Οι δύο εκκινητές εφαρμόζονται σε μοριακή περίσσεια Σύνδεση των συμπληρωματικών περιοχών Σύνδεση των συμπληρωματικών περιοχών Καθώς το DNA ψύχεται, παρεμβάλλονται μεταξύ των δύο προτύπων κλώνων Καθώς το DNA ψύχεται, παρεμβάλλονται μεταξύ των δύο προτύπων κλώνων Η βέλτιστη θερμοκρασία ποικίλει ανάλογα με το μήκος του εκκινητή κ.λ.π. Η βέλτιστη θερμοκρασία ποικίλει ανάλογα με το μήκος του εκκινητή κ.λ.π. Τυπική θερμοκρασία από 40 έως 60 ο C

21 Επέκταση Η DNA πολυμεράση αντιγράφει το DNA Η DNA πολυμεράση αντιγράφει το DNA Βέλτιστη θερμοκρασία 72 ο C Βέλτιστη θερμοκρασία 72 ο C

22 PCR Ενίσχυση Εκθετική ενίσχυση του προτύπου DNA

23 P olymerase C hain R eaction Συνθέτει μόνο το γονίδιο που μας ενδιαφέρει χρήση Forward και Reverse εκκινητών (ειδικά μικρά κομμάτια DNA) με τη βοήθεια του ενζύμου πολυμεράση. Όλοι οι κύκλοι ακολουθούν ένα αυστηρό χρονοδιάγραμμα θερμοκρασιών. Το γονίδιο που μας ενδιαφέρει Forward εκκινητής πρώτος cDNA κλώνος Reverse εκκινητής δεύτερος cDNA κλώνος Η κοπή περιορισμού του πλασμιδίου απελευθερώνει τις αλληλουχίες του DNA που μας ενδιαφέρουν πλασμίδιο DNA   DNA - αλληλουχία σε ένα πλασμίδιο

24 PCR 5’3’ 5’3’ Mg++

25 Τυπικό PCR μίγμα Σε έναν λεπτό σωλήνα Eppendorf συγκεντρώνουμε τα ακόλουθα DNA πρότυπο, που περιέχει το τμήμα του DNA που ενισχύεται. DNA πρότυπο, που περιέχει το τμήμα του DNA που ενισχύεται. Δύο εκκινητές, (βιοτινυλιωμένοι) έναν forward και έναν reverse, οι όποιοι καθορίζουν την αρχή και το τέλος της περιοχής που θα ενισχυθεί. Δύο εκκινητές, (βιοτινυλιωμένοι) έναν forward και έναν reverse, οι όποιοι καθορίζουν την αρχή και το τέλος της περιοχής που θα ενισχυθεί. Taq πολυμεράση (ή άλλη θερμοανθεκτική πολυμεράση), η DNA πολυμεράση που αντιγράφει την περιοχή που θα ενισχυθεί. Taq πολυμεράση (ή άλλη θερμοανθεκτική πολυμεράση), η DNA πολυμεράση που αντιγράφει την περιοχή που θα ενισχυθεί.DNA πολυμεράση DNA πολυμεράση Τριφωσφορικά δεοξυνουκλεοτίδια, (dNTPs) από τα οποία η DNA πολυμεράση χτίζει το νέο DNA (2Mm). Τριφωσφορικά δεοξυνουκλεοτίδια, (dNTPs) από τα οποία η DNA πολυμεράση χτίζει το νέο DNA (2Mm). Ρυθμιστικό διάλυμα, που παρέχει ένα κατάλληλο χημικό περιβάλλον για την DNA πολυμεράση [(x10) 100mM Tris-HCl, Ph 8.3 – 500mM KCl – 15mM MgCl (προαιρετικά)]. Ρυθμιστικό διάλυμα, που παρέχει ένα κατάλληλο χημικό περιβάλλον για την DNA πολυμεράση [(x10) 100mM Tris-HCl, Ph 8.3 – 500mM KCl – 15mM MgCl (προαιρετικά)]. Mg +2 κατιόν μαγνησίου (σε μορφή MgCl 2 25 mM,διαλυτά σύμπλοκα με τα dNTPs για εύκολη ενσωμάτωσή τους στην αλυσίδα του DNA ) ή ιόντα μαγγάνιου. Mg +2 κατιόν μαγνησίου (σε μορφή MgCl 2 25 mM,διαλυτά σύμπλοκα με τα dNTPs για εύκολη ενσωμάτωσή τους στην αλυσίδα του DNA ) ή ιόντα μαγγάνιου.ιόντα Μονοσθενή κατιόντα καλίου Μονοσθενή κατιόντα καλίου Αποστειρωμένο απιονισμένο νερό. Αποστειρωμένο απιονισμένο νερό. Πάγο. Πάγο. Αγαρόζη. Αγαρόζη. 6X διάλυμα φόρτωσης δειγμάτων. 6X διάλυμα φόρτωσης δειγμάτων. Διάλυμα βρωμιούχου εθιδίου (10mg/ml). Διάλυμα βρωμιούχου εθιδίου (10mg/ml).

26 PCR βελτιστοποίηση Βελτιστοποίηση ακινητοποίησης ολιγονουκλεοτιδίων ανιχνευτών. Βελτιστοποίηση ακινητοποίησης ολιγονουκλεοτιδίων ανιχνευτών. Υπόστρωµα - Υψηλή οµοιογένεια - Χαµηλός αυτοφθορισµός. Ολιγονουκλεοτίδιο ανίχνευσης. Καθαρότητα → Ευαισθησία Μήκος Χηµεία σύνδεσης → Σταθερότητα κατά τα επόµενα στάδια υβριδισµού και έκπλυσης (θερµοκρασίες 4°C έως 95°C, τιµές pH 1 έως 10, ιονική ισχύ σε NaCl από 0 έως 4 M). Ικανή συγκέντρωση στην επιφάνεια ώστε να έχουµε υψηλό σήµα χωρίς στερεοχηµική παρεµπόδιση. Βελτιστοποίηση υβριδισµού ολιγονουκλεοτιδίων στόχων. Βελτιστοποίηση υβριδισµού ολιγονουκλεοτιδίων στόχων. Επαρκής ενσωµάτωση µορίων σηµατοδότησης (ιχνηθετών) κατά την PCR. Σύσταση του διαλύµατος υβριδισµού: ιονική ισχύς, αποδιατακτικοί παράγοντες, κλπ. Θερµοκρασία υβριδισµού Tm : θερµοκρασία στην οποία τα πλήρως συµπληρωµατικά ολιγονουκλεοτίδια βρίσκονται συµπλεγµένα κατά 50% Td : θερµοκρασία σε µια συγκεκριµένη συγκέντρωση άλατος και ολιγονουκλεοτιδίων στην οποία το 50% ενός ολιγονουκλεοτιδίου είναι συµπλεγµένο µε το πλήρως συµπληρωµατικό του Td= 2°C (A+T) + 4°C(G+C). Η θερµοκρασία υβριδισµού και το µήκος του ακινητοποιηµένου ολιγονουκλεοτίδιου είναι καθοριστικοί παράγοντες της ειδικότητας του υβριδισµού. Εκπλύση µε διαλύµατα µειούµενης ιονικής ισχύος. Μείωση σήµατος φθορισµού ↔ Αύξησηειδικότητας.

27 Εφαρμογές Γενετική δακτυλοσκοπία Γενετική δακτυλοσκοπία Δοκιμή πατρότητας Δοκιμή πατρότητας Ανίχνευση των κληρονομικών Ανίχνευση των κληρονομικώνασθενειών Κλωνοποίηση γονιδίων Κλωνοποίηση γονιδίων Μεταλλαξιγένεση Μεταλλαξιγένεση Ανάλυση αρχαίου DNA Ανάλυση αρχαίου DNA Γενοτύπηση συγκεκριμένων μεταλλαγών Γενοτύπηση συγκεκριμένων μεταλλαγών Σύγκριση της έκφρασης γονιδίων Σύγκριση της έκφρασης γονιδίων

28 Πρακτικές τροποποιήσεις στη pcr τεχνική RT-PCR RT-PCR Nested PCR Nested PCR Intersequence specific (ISSR) PCR Intersequence specific (ISSR) PCR FISSR-PCR FISSR-PCR Ligation-mediated PCR Ligation-mediated PCR Inverse PCR Inverse PCR Vectorette-PCR Vectorette-PCR Assembly PCR Assembly PCR Asymmetric PCR-Late PCR Asymmetric PCR-Late PCR Quantitative PCR Quantitative PCR –Quantitative real-time PCR Taqman PCR Taqman PCR Sybr Green PCR Sybr Green PCR Touchdown PCR Touchdown PCR Hot-start PCR Hot-start PCR Colony PCR Colony PCR RACE-PCR RACE-PCR Multiplex (Πολυσύνθετη) - PCR Multiplex (Πολυσύνθετη) - PCR Ειδικής μεθυλίωσης PCR Ειδικής μεθυλίωσης PCR In Situ PCR In Situ PCR AFLP PCR AFLP PCR

29 Πρόσφατες εξελίξεις στις PCR τεχνικές Helicase-dependent amplification (HDA) Helicase-dependent amplification (HDA) TAIL PCR TAIL PCR Meta-PCR Meta-PCR

30 Ανάλυση της γονιδιακής έκφρασης με χρήση της RT-PCR

31 Τι αντιπροσωπεύει ο όρος “RT-PCR”? Περιλαμβάνει 2 διαδικασίες : RT – Reverse Transcription (Αντίστροφη μεταγραφή) Κατά τη διάρκεια αυτού του βήματος συνθέτουμε μονόκλωνο DNA από RNA πρότυπο PCR – Polymerase chain reaction Με χρήση ειδικών για το γονίδιο εκκινητών ενισχύουμε we amplify a ορισμένα τμήματα του γονιδίου που μας ενδιαφέρουν για να πετύχουμε αρκετή ποσότητα για περεταίρω ανάλυση

32 DNA: διπλή έλικα– πολύ σταθερή, διαταγμένη Χρησιμοποιείται από τα κύτταρα για να αποθηκεύει πληροφορίες (χρωμοσώματα) Υλικό της κληρονομικότητας Χρησιμοποιείται στις εγκληματολογικές επιστήμες Χρησιμοποιείται από τους αρχαιολόγους(~ χρόνια) DNA και RNA – Ποια είναι η διαφορά!

33 RNA: απλή έλικα– ασταθής, ισχυρές δευτεροταγείς δομές Χρησιμοποιείται από τα κύτταρα για την προσωρινή έκφραση της πληροφορίας Το προφίλ του κυτταρικού RNA αλλάζει από λεπτό σε λεπτό Αποικοδομείται πολύ εύκολα– και κατά την διαδικασία της απομόνωσης DNA και RNA – Ποια είναι η διαφορά!

34 Το DNA αντιγράφει τις πληροφορίες με μια διαδικασία που περιλαμβάνει πολλά ένζυμα Το DNA κωδικεύει για την παραγωγή messenger RNA (mRNA) ή γενικά RNA Στα ευκαρυωτικά κύτταρα, το mRNA επεξεργάζεται (ουσιαστικά με το μάτισμα) και μεταναστεύει από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασμα Το Messenger RNA μεταφέρει τις γενετικές πληροφορίες στο ριβόσωμα. Τα ριβοσώματα «διαβάζουν" αυτές τις πληροφορίες και τις χρησιμοποιούν για να συνθέσουν πρωτείνες Το κεντρικό δόγμα της μοριακής βιολογίας UNIDIRECTIONAL

35 Πως δουλεύει η μεταγραφή? Η μεταγραφή αρχίζει και το mRNA επιμηκύνεται Το ένζυμο της μεταγραφής συνδέεται στο δίκλωνο DNA, χωρίζει τους κλώνους και DNA φτιάχνει μια θηλιά. Η επιμήκυνση συνεχίζεται μέχρι το τέλος της μεταγραφικής μονάδας

36 RNA ιός (Ρετροϊός) Ιός Η ανακάλυψη της αντίστροφης μεταγραφάσης Δίκλωνο ιϊκό DNA Μονόκλωνο ιϊκό DNA Δεν περιέχει DNA Πρωτοαναγνωρίστηκε γιατί προκαλούσε διάφορους καρκίνους στα ζώα Καρκινικά κύτταρα έχουν γενετική σταθερότητα Το RNA δεν είναι σταθερό για σταθερή επιμόλυνση Πως οι ιοί πρόκλησης καρκίνου RNA προκαλούν καρκίνο;;;

37 Είναι το κεντρικό δόγμα μια “ιερή αγελάδα”; ? Υπάρχει εδώ επιστροφή;;;

38 Δύο διαφορετικές ερευνητικές ομάδες, η μια καθοδηγούμενη από τον Temin και η άλλη από τον David Baltimore, ταυτόχρονα ανακάλυψαν την άγνωστη μέχρι τότε υπεύθυνη για την αντιγραφή από RNA σε DNA πολυμεράση σε καθαρά ιοσώματα μετά από πολλά χρόνια κοπιαστικών εργαστηριακών ερευνών. Η ανακάλυψη της αντίστροφης μεταγραφάσης 1970: 1975: Οι Temin και Baltimore πήραν το Βραβείο Nobel στην Φυσιολογία ή την Ιατρική για την ανακάλυψη της αντίστροφης μεταγραφάσης

39 Η αντίστροφη μεταγραφή χρησιμοποιεί ένα μονόκλωνο RNA πρότυπο για να δομήσει δίκλωνο DNA. Τι κάνει η αντίστροφη μεταγραφή; copy ccc

40 Πως μπορεί αυτό να χρησιμοποιηθεί στην έρευνα; μεταγραφή transcription AAAAA mRNA Εξαιρετικό εργαλείο για την μελέτη γονιδίων που πραγματικά εκφράζονται σε διάφορους τύπους κυττάρων/ιστών/οργάνων. Καταγραφή αλλαγών της γονιδιακής έκφρασης κατά την διάρκεια περιβαλλοντικών επιδράσεων Αντίστροφη μεταγραφή cDNA ανάλυση

41 Ας αρχίσουμε! ολικό RNA tRNA rRNA mRNA ~ 1% Το περισσότερο από το RNA είναι ασήμαντο για μας (tRNA, rRNA) Ο mRNA πληθυσμός αποτελείται από περίπου διαφορετικά είδη Ισχυρή δευτεροταγής δομή– το ένζυμο δεν μπορεί να δουλέψει AAAAA Μόνο το mRNA έχει μια πολύ-αδενυλική ουρά στό 3’ άκρο RNA απομόνωση

42 RT αντίδραση – βήμα-βήμα AAAAA 65 ºC + πάγος 37 ºC TTTTT Αντίστροφη μεταγραφή dATP dCTP dGTP dTTP RNase καταστολέας mRNA 1. αποδιάταξη AAAAA TTTTT mRNA 2. αναδιάταξη + επιμήκυνση TTTTT cDNA AAAAA 37 ºC RT cDNA RT RT έτοιμη

43 Τι θα γινόταν με το cDNA μας τώρα? Προβλήματα: Τεράστια ποικιλία από cDNA μόρια (τουκάχιστον διαφορετικά είδη) Μόνο ένα αντίγραφο DNA υπάρχει για κάθε mRNA κλώνο Άφθονα (housekeeping) γονίδια δίνουν το 90% του πληθυσμού του mRNA They mask our gene of interest Λύση: χρειαζόμαστε μία αντίδραση που να μπορεί να ενισχύσει το μικρής αφθονίας γονίδιο ΚΑΙ ειδικά αρκετά μη ενισχυόμενα άλλα cDNAs +++ Επιπλέον χρειαζόμαστε ένα ένζυμο που μπορεί να αντιγράφει το DNA

44 Το DNA αντιγράφει τις πληροφορίες με μια διαδικασία που καλείται “αντιγραφή” DNA αντιγραφή σε έναν δοκιμαστικό σωλήνα Μπορούμε να χρησιμοποιήσουμε αυτό σε πρότυπο cDNA; Το ένζυμο που κάνει τη δουλειά: DNA-DNA πολυμεράση

45 5` 3` Πως δουλεύει η DNA-DNA πολυμεράση 5` 3`5` 3` 5` ολιγομερές - Τι θα συνέβαινε αν αποδιατάσσαμε και συνδέαμε ένα ολίγομερές προς τα πίσω… 1985: Kary B. Mullis 5` Pol 3` 5`3`5`3` 5` ολιγομερές Pol 5` ολιγομερές Κατασκευή ενός αντίγραφου κλώνου!Θα φτιάχναμε έναν δεύτερο!! … και επαναλαμβάνουμε αυτό ξανά και ξανά ; 5` 3` Pol

46 Polymerase Chain Reaction (PCR) 3 κύκλοι – 2 4 κύκλοι – 4 5 κύκλοι – κύκλοι – κύκλοι – κύκλοι – Κύκλος #4 Κύκλος #5

47 Πως θα ενισχύσουμε τα γονίδια που μας ενδιαφέρουν από την cDNA “σούπα”; TTTTT cDNA AAAAA TTTTT AAAAA cDNA TTTTT AAAAA cDNA PCR νοερή εικόνα πηκτής γονίδιο #2 750 bp 500 bp γονίδιο #1 Ειδικοί για το γονίδιο εκκινητές

48 Η RT–PCR στους εργαστηριακούς πάγκους ολικό RNA + ολιγοdT 37 ºC – 1 ώρα επαναδιάταξη + επιμήκυνση 65ºC – 10 min αποδιάταξη Πρόσθεση: Ένζυμο dNTPs RNasin RT έτοιμη RT: PCR: DNA pol dNTPs εκκινητές Ρυθμιστικό διάλυμα MgCl 2 95ºC 3 min αποδιάταξη ενίσχυση 95ºC – 30 sec 55ºC – 30 sec 72ºC – 1 min 72ºC 10 min τέλος PCR έτοιμη πρότυπο 1-5 ul Ανάλυση σε πηκτή 30 κύκλοι

49 Εφαρμογές της RT-PCR Κλωνοποίηση γονιδίων (εκφραζόμενοι σχηματισμοί) (όχι γενωμική έκδοση) Καταγραφή του επιπέδου της γονιδιακής έκφρασης σε κάθε ιστό Καταγραφή των αλλαγών στην έκφραση κατά την διάρκεια θεραπευτικής αγωγής Εξελιγμένη RT-PCR: (Η πραγματικού χρόνου) real time PCR Αλληλούχιση σε ολόκληρο το mRNA προφίλ EST (Expressed Sequence Tags) – βάση δεδομένων Μικροσυστοιχίες (DNA chip) Διάγνωση and εύκολη αντιδιαστολλή μεταξύ διαφορετικών τύπων καρκίνου Έγκαιρο εντοπισμό κρυφών ασθενειών κλπ…

50 Standard PCR ποιοτική ποιοτική Μικρός φόρτος εργασίας Μικρός φόρτος εργασίας μετα-PCR βήμα (Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης) μετα-PCR βήμα (Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης) υψηλό ρίσκο μόλυνσης υψηλό ρίσκο μόλυνσης εξειδίκευση ανάλογη με το μέγεθος εξειδίκευση ανάλογη με το μέγεθος ζώνες μπορεί να είναι προωθημένες (αλληλούχιση/ περιοριστικά ένζυμα) ζώνες μπορεί να είναι προωθημένες (αλληλούχιση/ περιοριστικά ένζυμα)

51 Standard PCR θερμοκυκλωτήρες Thermal Uniformity: ±0.5°C within 30 seconds of arrival at 60°C Ramping Speed: 60: up to 1°C/second, 96: up to 1.4°C/second, 96AgV: up to 2.5°C/second, 16MS: up to 0.5°C/second PTC-100® Peltier Thermal Cycler MJ Research

52 Real-Time PCR

53 ποσοτική ποσοτική ειδική (ποικίλει με τη χημεία) ειδική (ποικίλει με τη χημεία) Αρκετή δουλειά Αρκετή δουλειά Απαλοιφή μετα-PCR βήματος Απαλοιφή μετα-PCR βήματος μειωμένο ρίσκο μόλυνσης μειωμένο ρίσκο μόλυνσης Υψηλότερο κόστος αντιδραστηρίων Υψηλότερο κόστος αντιδραστηρίων Ποικιλία χημικών αντιδράσεων Ποικιλία χημικών αντιδράσεων –Sybr Green™ –TaqMan™ –Scorpion™ –Hybridization Probes –Simple Probes –Molecular Beacons Multiplex ικανότητα σε κάποιες χημικές αντιδράσεις Multiplex ικανότητα σε κάποιες χημικές αντιδράσεις

54 Πως λειτουργεί η Real- Time PCR

55 Real-Time PCR δεδομένα

56 SYBR Green εντοπισμός χρωστικές συνδέονται με το δίκλωνο DNA χρωστικές συνδέονται με το δίκλωνο DNA Ανάλυση καμπύλης τήξης Ανάλυση καμπύλης τήξης ποιοτική/ ποσοτική ποιοτική/ ποσοτική Μικρή εξειδίκευση Μικρή εξειδίκευση γενικά singleplex γενικά singleplex

57

58 Μοριακός φάρος

59 Σκορπιός

60 Σύνοψη των δεικτών σχημάτων Σύνοψη των δεικτών σχημάτων Απλού δείκτη σχήμα: Απλός φθορίζων ιχνηθετημένος δείκτης. Το σήμα φθορισμού εξαρτάται από την κατάσταση υβριδισμού (Fluorescein) Απλού δείκτη σχήμα: Απλός φθορίζων ιχνηθετημένος δείκτης. Το σήμα φθορισμού εξαρτάται από την κατάσταση υβριδισμού (Fluorescein) Hybδείκτη σχήμα: Διπλού δείκτη σύστημα αξιοποιεί FRET μεταξύ υβριδοποιημένων ιχνηθετημένων δεικτών Το LightTyper σύστημα SNP αναγνώριση των καμπυλών τήξης

61 R TaqMan χημεία Real Time/Quantitative PCR

62 Χημεία μοριακού φάρου 5´/3´ (αναφορέας / αποσβέστης) διπλοϊχνηθετημένα ολιγονουκλεοτίδια μονομόρια stem-loop δομή με απουσία στόχουstem-loop εσωτερική φουρκέτα φέρουσα τις ομάδες των αναφορέων και των αποσβεστών σε φυσική εγγύτητα FRET προσαρμοστική αλλαγή με υβριδισμό κάθε σημπληρωματικού στόχου (δι- μόρια προσαρμογή) Μοριακός δείκτης ξεδιπλώνονται και υβριδίζουν με την παρουσία του στόχου αναφορέα του οποίου η χρωστική εκπέμπει φθορίζοντα σήματα

63 Χημεία μοριακού φάρου Ο δείκτης - υβρίδιο στόχος δεν μπορεί να συνυπάρξει με το τον μίσχο - υβρίδιο λόγω της δυσκαμψίας των DNA ελικασών. Εξαιρετικό τέριασμα δείκτη - υβριδίου είναι ενεργητικά πιό σταθερό από τη δομή της λούπας- μίσχου. Μη τέριασμα δείκτη – υβριδίου στόχου είναι ενεργητικά λιγότερο σταθερό από τη δομή του μίσχου- λούπας. εξαιρετική εξειδίκευση Λούπα Ακολουθία από 15 (υψηλό GC%) έως 30 (χαμηλό GC%) βάσεις Ακολουθία υβριδοποιημένη με ακολουθίες του σημπληρωματικού στόχου Μίσχος 5-7 βάσεις (Tm 55-70°C) 3´και 5´άκρα οδηγούν αναφορέα /αποσβέστη Χρωστική Αναφορέας: Fluo, Fam, Hex, Tet, Rox, Tamra, Cy3, Cy5,.. Αποσβέστης: BHQs, Dabcyl,... Real Time/Quantitative PCR

64 Επιπλέον Βιβλιογραφία vcell.ndsu.nodak.edu/~christjo/vcell/animationSite/transcription/movie.htm flowchart/clo_pcr_strategy/primer_design.html


Κατέβασμα ppt "Polymerase Chain Reaction (PCR) Διδακτικά σχήματα 3 η Εργασία – θέμα 2 ο Μπακολίτσας Κώστας."

Παρόμοιες παρουσιάσεις


Διαφημίσεις Google