Η παρουσίαση φορτώνεται. Παρακαλείστε να περιμένετε

Η παρουσίαση φορτώνεται. Παρακαλείστε να περιμένετε

ΣΥΝΘΕΣΗ ΚΥΤΤΑΡΙΚΟΥ ΤΟΙΧΩΜΑΤΟΣ ΒΑΚΤΗΡΙΩΝ – ΧΡΩΣΕΙΣ ΣΤΗ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ Γαντά Σοφία Ειδικευόμενη Ιατρικής Βιοπαθολογίας Α.Ν.Θ. Θεαγένειο Συντονίστρια: Δρ.

Παρόμοιες παρουσιάσεις


Παρουσίαση με θέμα: "ΣΥΝΘΕΣΗ ΚΥΤΤΑΡΙΚΟΥ ΤΟΙΧΩΜΑΤΟΣ ΒΑΚΤΗΡΙΩΝ – ΧΡΩΣΕΙΣ ΣΤΗ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ Γαντά Σοφία Ειδικευόμενη Ιατρικής Βιοπαθολογίας Α.Ν.Θ. Θεαγένειο Συντονίστρια: Δρ."— Μεταγράφημα παρουσίασης:

1 ΣΥΝΘΕΣΗ ΚΥΤΤΑΡΙΚΟΥ ΤΟΙΧΩΜΑΤΟΣ ΒΑΚΤΗΡΙΩΝ – ΧΡΩΣΕΙΣ ΣΤΗ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ Γαντά Σοφία Ειδικευόμενη Ιατρικής Βιοπαθολογίας Α.Ν.Θ. Θεαγένειο Συντονίστρια: Δρ. Χατζηδημητρίου Μαρία

2  Τα βακτήρια είναι προκαρυωτικοί, συνήθως μονοκύτταροι μικροοργανισμοί  Διακρίνονται με το οπτικό μικροσκόπιο (μέγεθος < 0.2 μm)  Όταν καλλιεργούνται σε θρεπτικά υλικά σχηματίζουν μακροσκοπικά ορατές δομές, τις αποικίες

3 ΜΟΡΦΟΛΟΓΙΚΗ ΤΑΞΙΝΟΜΗΣΗ ΤΩΝ ΒΑΚΤΗΡΙΩΝ  Σφαιρική μορφή (σταφυλόκοκκοι, στρεπτόκοκκοι, διπλόκοκκοι, τετραδικοί, σαρκίνες)  Βακτηρίδια (σχήμα επίμηκες, >)  Δονάκια (σχήμα επίμηκες και κεκαμμένο, >)  Σπειρύλια (σχήμα επίμηκες με κάμψεις περισσότερες από μία)  Σπειροχαίτες (έχουν λεπτό επίμηκες ευκίνητο σώμα, περιεστραμμένο περί τον επιμήκη άξονά του)

4 ΜΟΡΦΟΛΟΓΙΚΗ ΤΑΞΙΝΟΜΗΣΗ ΤΩΝ ΒΑΚΤΗΡΙΩΝ

5

6 ΔΟΜΗ ΒΑΚΤΗΡΙΩΝ  Κυτταρικό τοίχωμα  Κυτταρική μεμβράνη  Κυτταρόπλασμα  Βακτηριακό DNA  Πλασμίδια  Κοκκία  Ριβοσώματα Κάποια βακτήρια μπορεί να φέρουν εξωτερικές δομές: •Έλυτρο •Μαστίγια και βλεφαρίδες

7 ΤΟ ΒΑΚΤΗΡΙΑΚΟ ΚΥΤΤΑΡΟ

8

9 ΚΥΤΤΑΡΙΚΟ ΤΟΙΧΩΜΑ  Περικλείει το πρωτόπλασμα  Εντοπίζεται εξωτερικά από την κυτταρική μεμβράνη  Είναι δομή πάχους 10-25nm,ανθεκτική, άκαμπτη με μικρή ελαστικότητα, πορώδης  Ελεύθερα διαπερατή σε μόρια μάζας < 10kDa και διαμέτρου < 1nm

10  Η σύνθεση του τοιχώματος διαφέρει σημαντικά στα διάφορα είδη βακτηρίων  Βασικό συστατικό του κυτταρικού τοιχώματος είναι η πεπτιδογλυκάνη  Ετεροδιμερές που αποτελείται από μόρια Ν- ακετυλογλυκοζαμίνης και Ν-ακετυλομουραμικού οξέος  Συνεχές περίβλημα γύρω από το πρωτόπλασμα  Το πάχος του στρώματος αυτού παίζει σημαντικό ρόλο στη διαφοροποίηση των βακτηρίων  Η παρατήρηση των βακτηρίων επιτυγχάνεται καλύτερα μετά από ξήρανση, μονιμοποίηση στην αντικειμενοφόρο πλάκα και χρώση με διάφορες χρωστικές

11 ΚΥΤΤΑΡΙΚΟ ΤΟΙΧΩΜΑ-ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΕΣ  Βοηθά στη διατήρηση του σχήματος των μικροβίων  Προστατεύει την κυτταρική μεμβράνη από την υψηλή ωσμωτική πίεση του πρωτοπλάσματος  Παίζει σημαντικό ρόλο στην κυτταρική διαίρεση  Περιέχει αντιγόνα που διεγείρουν την παραγωγή αντισωμάτων στον ξενιστή

12 ΚΥΤΤΑΡΙΚΟ ΤΟΙΧΩΜΑ GRAM (+) ΜΙΚΡΟΒΙΩΝ  Πεπτιδογλυκάνη ή μουρεΐνη  Πολυσακχαριδικός σκελετός  Ν-ακετυλογλυκοζαμίνη  Ν-ακετυλομουραμικό οξύ  50% του κυτταρικού τοιχώματος  Καταστρέφεται από τη λυσοζύμη

13 ΚΥΤΤΑΡΙΚΟ ΤΟΙΧΩΜΑ GRAM (+) ΜΙΚΡΟΒΙΩΝ  Τειχοϊκά οξέα: πολυμερείς ενώσεις φωσφορικής ριβιτόλης και γλυκερόλης  Βρίσκονται στο κυτταρικό τοίχωμα και στην κυτταρική μεμβράνη  Αντιδρούν με ειδικά αντισώματα έναντι των μικροβίων  Με βάση την ύπαρξή τους ή όχι, τα μικρόβια διαχωρίζονται σε Gram (+) και Gram (-)

14 ΚΥΤΤΑΡΙΚΟ ΤΟΙΧΩΜΑ GRAM (+) ΜΙΚΡΟΒΙΩΝ

15 ΚΥΤΤΑΡΙΚΟ ΤΟΙΧΩΜΑ GRAM (-) ΜΙΚΡΟΒΙΩΝ  Λεπτό στρώμα πεπτιδογλυκάνης  Λιποπρωτεΐνες  Εξωτερική μεμβράνη (πορίνες)  Λιποπολυσακχαρίτες(LPS)  Δεν υπάρχουν τειχοϊκά οξέα

16 ΚΥΤΤΑΡΙΚΟ ΤΟΙΧΩΜΑ GRAM (-) ΜΙΚΡΟΒΙΩΝ

17 Διαφορές τοιχώματος Gram (+) Gram (-) •Αποτελούνται 50%- 90% από πεπτιδογλυκάνη •Έχουν τειχοïκά οξέα • Έχουν πολυσακχαρίτες •Αποτελούνται από λεπτότερο στρώμα πεπτιδογλυκάνης 5- 10% • Δεν έχουν τειχοϊκά οξέα • Εξωτερικά από την πεπτιδογλυκάνη υπάρχουν τρεις αλλεπάλληλες στιβάδες: α) λιποπρωτεΐνης, β) εξωτερικής μεμβράνης γ) λιποπολυσακχαριτών (LPS)

18 Διαφορές τοιχώματος Gram (+) Gram (-)

19  Ο Δανός ιατρός Christian Gram στα τέλη του 19ου αιώνα επινόησε μια χρώση, βασισμένη στη διαφορά της σύστασης του τοιχώματος των βακτηρίων  Τα βακτήρια με το παχύ στρώμα πεπτιδογλυκάνης και τα τειχοϊκά οξέα βάφονται θετικά κατά Gram  Τα βακτήρια με το λεπτό στρώμα πεπτιδογλυκάνης βάφονται αρνητικά κατά Gram

20 ΧΡΩΣΗ GRAM- ΔΙΑΛΥΜΑΤΑ  Κρυσταλλικό ιώδες  Lugol  Αλκοόλη 95 o  Φαινικούχος φουξίνη,σαφρανίνη ή ουδέτερο ερυθρό

21 ΚΡΥΣΤΑΛΛΙΚΟ ΙΩΔΕΣ  Κρυσταλλικό ιώδες 2g  Αλκοόλη 95%20 ml  Οξαλικό αμμώνιο 0.8 g  Απεσταγμένο νερό 80 ml

22 LUGOL  I 2 1 g  KI10 g  Απεσταγμένο νερό 100 mL

23 ΦΑΙΝΙΚΟΥΧΟΣ ΦΟΥΞΙΝΗ  Βασική φουξίνη 1 g  Αλκοόλη 95 o 10 mL  Φαινικό οξύ 5% 100 mL  Διαλύεται η βασική φουξίνη στην αλκοόλη και στη συνέχεια το διάλυμα αυτό προστίθεται στο φαινικό οξύ

24 ΚΛΑΣΙΚΗ ΧΡΩΣΗ GRAM – ΤΕΧΝΙΚΗ  Επίστρωση, ξήρανση, μονιμοποίηση  Κρυσταλλικό ιώδες 1’  Ξέπλυμα με νερό  Lugol 1’  Ξέπλυμα με νερό  Αποχρωματισμός με αλκοόλη 95 o Ξέπλυμα με άφθονο νερό  Φαινικούχος φουξίνη 1’  Πλύσιμο με νερό  Στέγνωμα, μικροσκόπηση με καταδυτικό φακό

25 ΕΡΜΗΝΕΙΑ ΤΗΣ ΧΡΩΣΗΣ GRAM  Με την εφαρμογή της πρώτης χρωστικής (κρυσταλλικό ιώδες) χρωματίζονται όλα τα βακτήρια  Μετά το ξέπλυμα, φεύγει η περίσσεια της χρωστικής  Με το Lugol μονιμοποιείται η πρώτη χρωστική επάνω στα βακτήρια

26 ΕΡΜΗΝΕΙΑ ΤΗΣ ΧΡΩΣΗΣ GRAM  Με την εφαρμογή της αλκοόλης τα Gram (-) βακτήρια, αποχρωματίζονται και έτσι μπορούν να δεχτούν την δεύτερη χρωστική (βασική φουξίνη), οπότε βάφονται κόκκινα  Στα Gram (+) βακτήρια, το παχύ στρώμα της πεπτιδογλυκάνης καθώς και τα τειχοϊκά οξέα του κυτταρικού τοιχώματος εμποδίζουν την αλκοόλη να δράσει, και έτσι αυτά παραμένουν ιώδη

27

28 Gram(-) βακτήριαGram(+) βακτήρια

29 ΚΛΑΣΙΚΗ ΧΡΩΣΗ GRAM – ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑ  Gram (+)  ΙΩΔΗ  Gram (-)  ΚΟΚΚΙΝΑ

30 Gram(+) θετικά βακτήρια Κόκκοι  Σταφυλόκοκκος  Στρεπτόκοκκος  Πνευμονιόκοκκος Βακτηρίδια (Ραβδοειδή) μη σπορογόνα  Κορυνοβακτηρίδιο  Λιστέρια Βακτηρίδια (Ραβδοειδή) σπορογόνα  Βάκιλλος  Κλωστηρίδιο

31 Gram(-) αρνητικά βακτήρια Κόκκοι  Ναϊσσέρια Βακτηρίδια (Ραβδοειδή) μη σπορογόνα Εντεροβακτηριακά  Εσχερίχια  Σαλμονέλλα  Σιγκέλλα  Κλεμπσιέλλα  Πρωτέας  Υερσίνια Μη εντερικά ΨευδομονάδεςΒρουκέλλεςΠαστερέλλεςΦρανσισέλλεςΑιμόφιλοςΜπορντετέλλεςΔονάκιαΣπειροχαιτιακά

32

33 ΣΦΑΛΜΑΤΑ  Μη σωστή εφαρμογή της τεχνικής  Η αλκοόλη δεν θα πρέπει να μείνει για περισσότερο από 30 sec, διότι τότε θα διαλύσει και τα τειχοϊκά οξέα των Gram (+) βακτηρίων, οπότε αυτά θα βαφούν κόκκινα με τη δεύτερη χρωστική  Τα μικρόβια θα πρέπει να προέρχονται από πρόσφατες καλλιέργειες  Σε αντίθετη περίπτωση, τα Gram (+) μικρόβια μπορεί να βαφούν κόκκινα, λόγω εκφύλισης των τειχοϊκών οξέων του κυτταρικού τους τοιχώματος

34 ΧΡΩΣΗ ZIEHL-NEELSEN  Χρησιμοποιείται για τη μικροσκόπηση  μυκοβακτηριδίων  ακτινομυκήτων  της Nocardia spp  ενδοσπορίων των βακτηρίων  κύστεων ορισμένων πρωτοζώων (Cryptosporidium spp)  Ονομάζεται οξεάντοχη  Επινοήθηκε το 1882 από τους Franz Ziehl και Friedrich Neelsen

35  Οξεαντοχή είναι φυσική ιδιότητα μερικών μικροοργανισμών που αναφέρεται στην ανθεκτικότητά τους να μην αποχρωματίζονται κατά τη διαδικασία της χρώσης κατόπιν επεξεργασίας με ισχυρά οξέα

36 ΧΡΩΣΗ ZIEHL-NEELSEN - ΑΡΧΗ  Στο τοίχωμα των βακτηρίων αυτών, στο εξωτερικό του στρώματος της πεπτιδογλυκάνης βρίσκονται συνδεδεμένα τα μυκολικά οξέα  β-Υδροξυ λιπαρά οξέα υψηλού μοριακού βάρους συνδεδεμένα με υδατάνθρακες  Αποτελούν φραγμό για τις υδατικές χρωστικές ουσίες  Όταν χρωματιστούν εν θερμώ με βασική χρωστική σχηματίζουν ένωση που δεν αποχρωματίζεται με ισχυρά οξέα

37 Κυτταρικό τοίχωμα Μυκοβακτηριδίων

38 ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ   Δείγματα ( πτύελα, βρογχικά, ούρα, Ε.Ν.Υ. και άλλα βιολογικά υγρά)   Μέθοδος Petroff (πτύελα)   Διάλυμα Α NaOH 4%   Διάλυμα Β Πενικιλίνη + θειικό οξύ   Τεχνική   Μετάγγιση 3-4 ml κάθε δείγματος σε σωληνάριο   Προσθήκη διαλύματος Α σε διπλάσια ποσότητα   Ανακίνηση με Vortex Ρευστοποίηση του δείγματος   Φυγοκέντρηση σε 3000 στρ για 20min   Απόρριψη υπερκειμένου σε δοχείο με λυζοφορμίνη   Επαναδιύληση του ιζήματος με 10 ml διαλύματος Β   Φυγοκέντρηση σε 3000 στρ για 20min   Απόρριψη υπερκειμένου σε δοχείο με λυζοφορμίνη   Καλή ανάδευση ιζήματος (Vortex),επίστρωση παρασκευασμάτων και εμβολιασμός θρεπτικών υλικών

39 ΧΡΩΣΗ ZIEHL-NEELSEN – ΔΙΑΛΥΜΑΤΑ  Φαινικούχος φουξίνη  Οξινισμένη αλκοόλη 95 o 3%  Κυανό του μεθυλενίου

40 ΦΑΙΝΙΚΟΥΧΟΣ ΦΟΥΞΙΝΗ  Βασική φουξίνη 1 g  Αλκοόλη 95 o 10 mL  Φαινικό οξύ 5% 100 mL  Διαλύεται η βασική φουξίνη στην αλκοόλη και στη συνέχεια το διάλυμα αυτό προστίθεται στο φαινικό οξύ

41 ΟΞΙΝΙΣΜΕΝΗ ΑΛΚΟΟΛΗ 95 o 3%  Αλκοόλη 95 o 97 mL  HCl 3 mL

42 ΚΥΑΝΟ ΤΟΥ ΜΕΘΥΛΕΝΙΟΥ  Μητρικό διάλυμα:  Κυανό του μεθυλενίου1 g  Αλκοόλη10 mL  Διάλυμα χρήσης:  Μητρικό διάλυμα30 mL  KOH 10%1 mL  Απεσταγμένο νερό100 mL  Το KOH προστίθεται στο νερό (ΠΟΤΕ ΤΟ ΑΝΤΙΘΕΤΟ!!!) και στη συνέχεια το διάλυμα αυτό προστίθεται στο μητρικό διάλυμα

43 ΧΡΩΣΗ ZIEHL-NEELSEN – ΤΕΧΝΙΚΗ  Φαινικούχος φουξίνη σε ολόκληρη την πλάκα πάνω από φλόγα, μέχρι να βγουν ατμοί (όχι φυσσαλίδες)  Αναμονή 2-3 min μετά την έκλυση των ατμών  Να μην ξεραθεί η χρωστική επάνω στο παρασκεύασμα

44 ΧΡΩΣΗ ZIEHL-NEELSEN – ΤΕΧΝΙΚΗ  Πλύσιμο με νερό  Αποχρωματισμός με οξινισμένη αλκοόλη για 1-2 min  Πλύσιμο με άφθονο νερό  Κυανό του μεθυλενίου για 1-3 min  Πλύσιμο με νερό  Ξήρανση, μικροσκόπηση (τουλάχιστον 300 πεδία)

45 ΧΡΩΣΗ ZIEHL-NEELSEN – ΕΡΜΗΝΕΙΑ  Η φαινικούχος φουξίνη βάφει όλα τα μικρόβια κόκκινα  Η θερμότητα χρησιμοποιείται για να βοηθήσει τη χρωστική να εισέλθει στο κυτταρόπλασμα των μυκοβακτηριδίων  Με την οξινισμένη αλκοόλη, αποχρωματίζονται όλα τα μικρόβια, εκτός από τα οξεάντοχα βακτηρίδια (οξεάντοχη χρώση)  Με το κυανό του μεθυλενίου βάφονται μπλε τα υπόλοιπα μικρόβια που βρίσκονται στα υλικά

46 ΧΡΩΣΗ ZIEHL-NEELSEN – ΕΡΜΗΝΕΙΑ  Το μυκοβακτηρίδιο της φυματίωσης περιέχει μυκολικά οξέα στην κυτταρική μεμβράνη και στο κυτταρόπλασμα  Τα οξέα αυτά εμποδίζουν τον αποχρωματισμό του από την οξινισμένη αλκοόλη, επειδή συνδέονται σταθερά με τη φαινικούχο φουξίνη

47 Χρώση ZIEHL-NIELSEN

48 ΧΡΩΣΗ ZIEHL-NEELSEN – ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑ

49

50 ΆΛΛΕΣ ΧΡΩΣΕΙΣ  Αρνητική χρώση  Χρώση σινικής μελάνης  Χρωματίζεται το περιβάλλον, ενώ το μικρόβιο μένει αχρωμάτιστο  Παίρνουμε πληροφορίες μόνο για το μέγεθος και το σχήμα των βακτηρίων

51 ΧΡΩΣΗ ΣΙΝΙΚΗΣ ΜΕΛΑΝΗΣ  Σε αντικειμενοφόρο πλάκα, επιστρώνεται το παθολογικό υλικό, ξηραίνεται και μονιμοποιείται  Προστίθεται μία σταγόνα σινικής μελάνης με τη βοήθεια καλυπτρίδας και ξηραίνεται στον αέρα  Μικροσκοπείται με καταδυτικό φακό και μία σταγόνα κεδρέλαιο

52 ΧΡΩΣΗ ΣΙΝΙΚΗΣ ΜΕΛΑΝΗΣ – ΕΛΥΤΡΟ

53 ΧΡΩΣΗ ΣΙΝΙΚΗΣ ΜΕΛΑΝΗΣ – ΜΥΚΗΤΕΣ

54 Σας ευχαριστώ για την προσοχή σας


Κατέβασμα ppt "ΣΥΝΘΕΣΗ ΚΥΤΤΑΡΙΚΟΥ ΤΟΙΧΩΜΑΤΟΣ ΒΑΚΤΗΡΙΩΝ – ΧΡΩΣΕΙΣ ΣΤΗ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ Γαντά Σοφία Ειδικευόμενη Ιατρικής Βιοπαθολογίας Α.Ν.Θ. Θεαγένειο Συντονίστρια: Δρ."

Παρόμοιες παρουσιάσεις


Διαφημίσεις Google