Τεχνικές Μοριακής Βιολογίας για τη Διάγνωση και Παρακολούθηση Λοιμωδών Νοσημάτων Έφη Πετεινάκη1,2 1Εργαστήριο Μικροβιολογίας, Ιατρική Σχολή Πανεπιστημίου.

Παρουσίαση με θέμα: "Τεχνικές Μοριακής Βιολογίας για τη Διάγνωση και Παρακολούθηση Λοιμωδών Νοσημάτων Έφη Πετεινάκη1,2 1Εργαστήριο Μικροβιολογίας, Ιατρική Σχολή Πανεπιστημίου."— Μεταγράφημα παρουσίασης:

1 Τεχνικές Μοριακής Βιολογίας για τη Διάγνωση και Παρακολούθηση Λοιμωδών Νοσημάτων
Έφη Πετεινάκη1,2 1Εργαστήριο Μικροβιολογίας, Ιατρική Σχολή Πανεπιστημίου Θεσσαλίας 2Εργαστήριο Μοριακής Μικροβιολογίας, Ινστιτούτο Βιο-Ιατρικής Έρευνας και Τεχνολογίας Λάρισας ΑΛΕΞΑΝΔΡΟΥΠΟΛΗ, ΙΑΝΟΥΑΡΙΟΥ 2008

2 Ο ΡΟΛΟΣ ΤΟΥ ΚΛΙΝΙΚΟΥ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΚΟΥ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟΥ ΕΙΝΑΙ Η ΓΡΗΓΟΡΗ ΚΑΙ ΑΞΙΟΠΙΣΤΗ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΤΟΥ ΛΟΙΜΟΓΟΝΟΥ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑ

3 ΣΤΟΧΟΙ Έναρξη αιτιολογικής θεραπείας
Λήψη κατάλληλων μέτρων πρόληψης της διασποράς του λοιμογόνου παράγοντα

4 ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΤΗΣ ΛΟΙΜΩΞΗΣ άμεση μικροσκόπηση του παθολογικού υλικού (πυοσφαίρια-μικροοργανισμοί) απομόνωση του μικροοργανισμού σε καθαρό καλλιέργεια ταυτοποίηση βάσει φαινοτυπικών και βιοχημικών χαρακτήρων έλεγχος της ευαισθησίας του μικροοργανισμού (ΑΝΤΙΒΙΟΓΡΑΜΜΑ)

5 ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΗΣΗ Περιορισμένη ειδικότητα και ευαισθησία
Παρουσία μεγάλου αριθμού μικροβίων (10.000/mL βιολογικού υγρού) Δυσχερής η μορφολογική αναγνώριση Εμπειρία

6 ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΙ ΤΗΣ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑΣ
Δυσκολίες στην απομόνωση μικροοργανισμών οι οποίοι αναπτύσσονται δύσκολα (Mycobacterium tuberculosis, Kingella κλπ) Αδυναμία απομόνωσης του παθογόνου αίτιου λόγω χορήγησης αντιμικροβιακής θεραπείας Αδυναμία διάγνωσης ιογενών λοιμώξεων ιο

7 ΟΡΟΛΟΓΙΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ Η εισαγωγή των ορολογικών
αντιδράσεων έδωσε λύση σε αρκετές αλλά όχι σε όλες τις περιπτώσεις Εξαιρετική βοήθεια στη διάγνωση των ιογενών λοιμώξεων Περιορισμοί

8 ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΙ ΤΗΣ ΟΡΟΛΟΓΙΚΗΣ ΔΙΑΓΝΩΣΗΣ
Απουσία αντισωμάτων στην αρχική φάση της νόσου Απαραίτητη η λήψη δύο δειγμάτων με διαφορά 15νθημέρου το ένα από το άλλο Αδυναμία παραγωγής αντισωμάτων σε άτομα με ανοσοανεπάρκεια Κατευθυνόμενη διάγνωση

9 Η εισαγωγή των μοριακών μεθόδων στην κλινική διαγνωστική έγινε κυρίως
για να επιλυθούν οι αδυναμίες των συμβατικών μεθόδων, έτσι ώστε ο λοιμογόνος παράγων να ταυτοποιείται αξιόπιστα και γρήγορα

10 Σύγχρονο Κλινικό Μικροβιολογικό Εργαστήριο
Σύγχρονο Κλινικό Μικροβιολογικό Εργαστήριο εξοικείωση με τη χρήση των μοριακών τεχνικών επιλογή και σχεδιασμός καταλληλότερης μεθοδολογίας, η οποία κατά κύριο λόγο εξαρτάται από το κλινικό δείγμα εμπορικά kits, in house μέθοδοι περιορισμός του κόστους, ασφάλεια

11 ΣΥΝΗΘΕΙΣ ΜΟΡΙΑΚΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΣΤΗΝ ΚΛΙΝΙΚΗ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ
η τεχνική της αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης (PCR) η τεχνική του υβριδισμού η ηλεκτροφόρηση σε παλλόμενο ηλεκτρικό πεδίο (PFGE)

12 Επιλογή Μεθοδολογίας Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης Υβριδισμός
στην ανίχνευση γενετικού μικροβιακού υλικού ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΛΟΙΜΩΞΗΣ Ηλεκτροφόρηση σε παλλόμενο ηλεκτρικό πεδίο σύγκριση της γενετικής ομοιότητας ανάμεσα σε μικροοργανισμούς ΠΡΟΛΗΨΗ ΔΙΑΣΠΟΡΑΣ ΤΩΝ ΛΟΙΜΩΞΕΩΝ

13 Πολλαπλασιασμός ενός επιλεγμένου τμήματος
Βασικές αρχές της PCR Πολλαπλασιασμός ενός επιλεγμένου τμήματος μικροβιακού DNA Χρησιμοποιείται ένα ζεύγος εκκινητών (primers),που έχουν συμπληρωματική αλληλουχία με τα άκρα του DNA-στόχου Ο κάθε κύκλος της PCR περιλαμβάνει στάδια 1. Αποδιάταξη του DNA στόχου (θέρμανση 94-95οC) 2. Σύνδεση των εκκινητών στα άκρα του DNA-στόχου 3. Επέκταση των συμπληρωματικών αλυσίδων, με τη βοήθεια του ενζύμου Taq-πολυμεράση Ης μεράση

14

15 Αρχή της PCR Θεωρητικά από 1 αντίγραφο DNA μπορεί να
παραχθούν εκατομμύρια αντίγραφα Χρησιμοποιείται σε δείγματα για ανίχνευση-χαρακτηρισμό γενετικού μικροβιακού υλικού Υψηλή ευαισθησία Χαμηλότερη ειδικότητα

16 Βασικές αρχές του υβριδισμού
Ομοιότητα του βακτηριακού DNA με την αλληλουχία του ιχνηθέτη που έχουμε επιλέξει Η πρόσδεση του βακτηριακού DNA με τον ιχνηθέτη ανιχνεύεται με διάφορους τρόπους

17 Χρησιμοποιείται για ανίχνευση-χαρακτηρισμό γενετικού μικροβιακού υλικού
Εξαιρετική ειδικότητα Υπολείπεται σε ευαισθησία σε σχέση με την PCR

18 ΒΑΣΙΚΕΣ ΑΡΧΕΣ ΤΗΣ ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗΣ ΣΕ ΠΑΛΛΟΜΕΝΟ ΗΛΕΚΤΡΙΚΟ ΠΕΔΙΟ (PFGE)
Πέψη με ειδικές ενδονουκλεάσες Ηλεκτροφόρηση Σύγκριση

19 Παράδειγμα 2 στελέχη S. aureus
…gatgcatggcatt/gtttgcattgcattttggtaaacctagatt…. ….gatgctgcggatgccgcatttt/gtttgcattgcattttggtaaacct……

20

21 ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΤΩΝ ΜΟΡΙΑΚΩΝ ΤΕΧΝΙΚΩΝ ΣΤΗΝ ΚΛΙΝΙΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΗ
ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΤΩΝ ΜΟΡΙΑΚΩΝ ΤΕΧΝΙΚΩΝ ΣΤΗΝ ΚΛΙΝΙΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΗ Άμεσα στο κλινικό δείγμα (4h) ανίχνευση-ταυτοποίηση του μικροοργανισμού ανίχνευση γονιδίων αντοχής και γονιδίων παθογονικότητας

22 Μεθοδολογία: PCR, υβριδισμός
ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ Ανίχνευση ιών, χλαμμυδίων κλπ Εφαρμογή αιτιολογικής θεραπείας Λήψη μέτρων πρόληψης Μεθοδολογία: PCR, υβριδισμός

23 ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΤΩΝ ΜΟΡΙΑΚΩΝ ΤΕΧΝΙΚΩΝ ΣΤΗΝ ΚΛΙΝΙΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΗ
ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΤΩΝ ΜΟΡΙΑΚΩΝ ΤΕΧΝΙΚΩΝ ΣΤΗΝ ΚΛΙΝΙΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΗ 2. Μοριακή ταυτοποίηση του μικροοργανισμού από καθαρό καλλιέργημα εφαρμογή στην ταυτοποίηση των μυκοβακτηριδίων κλπ Μεθοδολογία: PCR-υβριδισμός

24 ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΤΩΝ ΜΟΡΙΑΚΩΝ ΤΕΧΝΙΚΩΝ ΣΤΗΝ ΚΛΙΝΙΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΗ
ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΤΩΝ ΜΟΡΙΑΚΩΝ ΤΕΧΝΙΚΩΝ ΣΤΗΝ ΚΛΙΝΙΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΗ 3. Διερεύνηση ενδο-νοσοκομειακών λοιμώξεων Διασπορά από ασθενή σε ασθενή με σκοπό τη λήψη μέτρων πρόληψης Μεθοδολογία: PFGE

25 ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΤΩΝ ΜΟΡΙΑΚΩΝ ΤΕΧΝΙΚΩΝ ΣΤΗΝ ΚΛΙΝΙΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΗ
ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΤΩΝ ΜΟΡΙΑΚΩΝ ΤΕΧΝΙΚΩΝ ΣΤΗΝ ΚΛΙΝΙΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΗ 4. Διερεύνηση των μηχανισμών αντοχής αδυναμία των φαινοτυπικών μεθόδων Παράδειγμα: στελέχη S. aureus mecA(+) με ενδιάμεση αντοχή στα β-λακταμικά αντιβιοτικά Μεθοδολογία: PCR, etc

26 ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΤΩΝ ΜΟΡΙΑΚΩΝ ΤΕΧΝΙΚΩΝ ΣΤΗΝ ΚΛΙΝΙΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΗ
ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΤΩΝ ΜΟΡΙΑΚΩΝ ΤΕΧΝΙΚΩΝ ΣΤΗΝ ΚΛΙΝΙΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΗ 5. Κατανόηση της παθογένειας των λοιμώξεων π.χ. υποτροπιάζουσα φαρυγγοαμυγδαλίτιδα, υποτρπές ορθοπαιδικών λοιμώξεων (ενδοκυττάρια μικρόβια)

27 MOΡΙΑΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΗ ΤΩΝ ΛΟΙΜΩΞΕΩΝ
ΜΥΘΟΣ ή ΠΡΑΓΜΑΤΙΚΟΤΗΤΑ ???

28 Ερωτήματα Εφαρμογή στο εργαστήριο ρουτίνας και σε ποιες
Εφαρμογή στο εργαστήριο ρουτίνας και σε ποιες περιπτώσεις ??? Κόστος?? Εμπορικά kits ή in house μέθοδοι??

29 Άμεση ανίχνευση του μικροοργανισμού στο κλινικό δείγμα
Άμεση ανίχνευση του μικροοργανισμού στο κλινικό δείγμα ανίχνευση ιών (ιός ηπατίτιδας, ΑIDS) απάντηση σε συντομότερο διάστημα (π.χ. Mycobacterium tuberculosis) ανεξάρτητη από προηγηθείσα αντιμικροβιακή θεραπεία

30 Διάγνωση ιογενούς λοιμώξεως
Προσδιορισμός ιικού φορτίου (Real-time PCR) Προσδιορισμός μεταλλάξεων που σχετίζονται με αντοχή σε αντι-ικά φάρμακα

31 Ταχεία-αξιόπιστη διάγνωση φυματίωσης
Είναι απαραίτητη λόγω - αναγκαιότητα έναρξης θεραπευτικής αγωγής - απομόνωσης του ασθενούς (  stop transmission) - έναρξη προφυλακτικής αγωγής στο οικείο περιβάλλον ( prevent disease) σήμερα: συχνότητα νόσου -  πολυανθεκτικών TB (MDR-TB) (R to INH and RIF)

32 Ερωτηματικά στη ΤΒ διάγνωση βάσει ΖΝ
Είναι μυκοβακτηρίδιο? Αν ναι, είναι μυκοβακτηρίδιο φυματίωσης? Αν ναι, είναι ευαίσθητο? Αν ανήκει στα ΝΤΜ, ποιο είδος είναι και ποια η κλινική του σημασία?

33 Συνδυασμός κλασσικών και μοριακών τεχνικών-2007
ΖΝ χρώση Καλλιέργεια-απομόνωση-ταυτοποίηση-έλεγχος ευαισθησίας (14+10 ημέρες) Άμεση ανίχνευση γενετικού υλικού μυκοβακτηριδίου στο κλινικό δείγμα

34 ΜΟΝΟ ΓΙΑ ΔΕΙΜΑΤΑ ΤΟΥ ΑΝΑΜΝΕΥΣΤΙΚΟΥ ΣΥΣΤΗΜΑΤΟΣ
ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ Εμπορικά kits ( € /test) (1) LCx MT Assay (Abbott) Gap Ligase Chain Reaction, target: DNA (Protein Antigen B) the cheapest test (2) Amplified MT Direct Test (Gen-Probe, Biomerieux) Transcription - Mediated Amplification, target: rRNA (2x103 copies) the most sensitive test (3) Amplicor MTB PCR (Roche) Polymerase Chain Reaction, target: DNA (16S rRNA) detection of inhibition (4) BDProbeTec ET (Becton Dickinson) Strand Displacement Amplification, target: DNA (IS6110; 8-25 copies) TAT: 1 hour (!!!), detection of inhibition ΜΟΝΟ ΓΙΑ ΔΕΙΜΑΤΑ ΤΟΥ ΑΝΑΜΝΕΥΣΤΙΚΟΥ ΣΥΣΤΗΜΑΤΟΣ

35 Εφαρμογή μοριακών τεχνικών σε βρογχικές εκκρίσεις και πτύελα για ανίχνευση DNA Mycobacterium spp
ποικιλία μοριακών τεχνικών με δυνατότητα ανίχνευσης-ταυτοποίησης σε επίπεδο είδους εξαρτάται η ευαισθησία της μεθόδου από την ποιότητα του υλικού (περισσότερα από ένα δείγματα) Δεν ενδείκνυται για παρακολούθηση ασθενών που βρίσκονται υπό αντιφυματική αγωγή

36 Ανίχνευση μεταλλάξεων που σχετίζονται με αντοχή σε ΙΝΗ-RIF
Συνδυασμός PCR + υβριδισμού μέσα σε 4 ώρες Ανίχνευση της RIF-R  90.9% ευαισθησία Ανίχνευση της INH-R  94.4% ευαισθησία [Genotype MTBDR]

37

38 PCR απευθείας σε ΕΝΥ για ανίχνευση μικροβιακού DNA ( 4 ώρες)
48 (-) (-) μηνιγγίτιδα (+) (+) S. pneumoniae, N. meningitidis, H. influenzae type b Εξαρτάται η ευαισθησία της PCR στο αίμα από τον αριθμό των μικροβιακών κυττάρων ς

39 Περιορισμοί της κλασσικής PCR (επιλογή εκκινητών)
Aνάγκη εισαγωγής της 16S rRNA PCR Eκκινητές κοινοί για όλα τα βακτηριακά είδη Κτηριακά είδη

40 Εισαγωγή της ευρέως φάσματος 16S rRNA PCR στη διάγνωση των λοιμώξεων
μεγάλο φάσμα μικροοργανισμών ταυτοποίηση αξιόπιστη σε επίπεδο είδους χαρακτηρισμός νέων παθογόνων δυνατότητα ανίχνευσης περισσότερων από ένα είδη μικροοργανισμών δυνατότητα εφαρμογής στο εργαστήριο ρουτίνας ΕΝΥ, πλευριτικό, αρθρικό, ιστοί, αίμα κλπ

41 Συνδυασμός μοριακών και συμβατικών μεθόδων
Συνδυασμός μοριακών και συμβατικών μεθόδων Αίμα Υγρά (περιτοναικό, πλευριτικό, ΕΝΥ, αρθρικό) Πτύελα-Βρογχικές εκκρίσεις Ιστοί (ορθοπαιδικές λοιμώξεις, κλπ)

42 Παράλληλα με την κλασσική καλλιέργεια πρώτο στάδιο (απάντηση σε 4 h)
Απομόνωση DNA από το δείγμα (32 ασθενείς) Έλεγχος καταλληλότητας του DNA ( ύπαρξη DNA, απουσία αναστολέων) Χρησιμοποιείται ζεύγος εκκινητών κοινών για όλα τα μικρόβια (16S rRNA) Ύπαρξη ή όχι μικροβιακού DNA Αδυναμία ταυτοποίησης σε επίπεδο γένους και είδους

43 Προιόντα PCR μετά από πολλαπλασιασμό του 16S rRNA διαφόρων βακτηρίων
Προιόντα PCR μετά από πολλαπλασιασμό του 16S rRNA διαφόρων βακτηρίων. Γραμμή 1: μάρτυρας μοριακών βαρών, 2: Staphylococcus spp, 3: E. Coli, 4: Klebsiella spp, 5: Enterococcus spp, 6: S. pneumoniae, 7: Streptococcus spp, 8: Pseudomonas spp, 9: αρνητικός μάρτυρας

44 Δεύτερο στάδιο- ταυτοποίηση
Μέθοδος υβριδισμού (ταινίες με DNA συγκεκριμένων μικροβίων)-απάντηση σε ώρες ή Προσδιορισμός της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας κατά Sanger

45 ggaattactgggcgtaaagc gcacgcaggc ggttgcccaa
gtcagatgtg aaagccccgg gcttaacctgg gaactgca ttgaaactgg gcgactagag tatgaaagag gaaagcgga atttccagtgt agcagtgaaa tgcgtagata ttggaaggaa caccgatggc gaaggcagct ttctgggtcg atactgacgc tcatgtgcga aagcgtgggg agcaaacagg attagatacc ctggtagtcc acgccctaaa cgatgtcaac taggcgtcgg gttgttaaag actcggtgcc ggagctaacg cattaagttg accgcctggg gagtacggcc gcaaggttga aactcaaaga aattgacggg gacccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgatgc aacgcgaaga accttaccag gccttgacat cctaggaact tggcagagat gccttggtgc cttcgggaac ctagagacag gtgttgcatg gctgtcgtca gctcgtgtcg

46 Προσδιορισμός της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας
Ανάλυση κατά Sanger (sequencing) Σύγκριση της συγκεκριμένης αλληλουχίας μέσω μιας τράπεζας BLAST-GENOME Η ομοιότητα πρέπει να είναι πάνω από 97.5% για να είμαστε βέβαιοι ότι το βακτήριο ανήκει στο συγκεκριμένο γένος

47 Σύγκριση της αλληλουχίας
Cardiobacterium hominis 16S rRNA 100%

48 Ενδοκαρδίτιδα-PCR Βακτηριαιμία είναι συνεχής Αίμα ή καρδιακές βαλβίδες
Μικρόβια απαιτητικά, βραδέως αναπτυσσόμενα (ΗΑCEK) Ανεπάρκεια της κλασσικής καλλιέργειας βραδέως

49 Εμπειρία στο Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο της Λάρισας
Εμπειρία στο Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο της Λάρισας 4 περιστατικά στη διάρκεια ενός έτους ανίχνευση απευθείας σε αίμα S. mitis, S. mutans, Cardiobacterium hominis, Βartonella quintana ταχύτητα στη διάγνωση ( 17 ημέρες με την κλασσική καλλιέργεια) Petinaki et al, J Clin Microbiol 2006; 44:

50 PCR σε πλευριτικά-υγρά
συχνά οι καλλιέργειες είναι στείρες απαιτητικά μικρόβια προηγούμενη αντι-μικροβιακή θεραπεία Clostridium sordelii σε ασθενή με εμπύημα (4 προς 17 ημέρες) Petinaki et al, Scand J infect Dis 65: 34-39, 2008

51 PCR σε αρθρικά υγρά Oι καλλιέργειες ήταν αρνητικές σε όλα τα δείγματα
Από 29 δείγματα, σε 3 ανιχνεύθηκε DNA Kingellae kingae, 1 Streptococcus pneumoniae Oι καλλιέργειες ήταν αρνητικές σε όλα τα δείγματα

52 Απευθείας ανίχνευση μικροβιακού DNA σε αίμα ασθενών με PCR
No PCR σε αίμα κ/α αίματος (-) (-) (+) (+) Ειδικότητα % Ευαισθησία % Εξαρτάται η ευαισθησία της PCR στο αίμα από τον αριθμό των μικροβιακών κυττάρων

53 PCR σε ιστούς από ασθενείς με ορθοπαιδικές λοιμώξεις
Χαμηλή ευαισθησία των κλασσικών μεθόδων λόγω προηγούμενης αντι-μικροβιακής θεραπείας κακής λήψης δείγματος ανεπάρκεια του εργαστηρίου δημιουργία βιομεμβράνης μεικτή λοίμωξη, Alcanindiges illinoisensis, Comamonas terrigena, άγνωστα αναερόβια Raoult et al, J Clin Microbiol 2000,

54 Ορθοπαιδική Κλινική Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Λάρισας 2006
Ορθοπαιδική Κλινική Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Λάρισας 2006 52 ασθενείς Gram stain καλλιέργεια Παρουσία βακτηριακού DNA θετικά + +++ πυοσφαίρια Θετικά 22 Ασθενείς 52 αρνητικά + + ++ Αρνητικά 30

55 Ταυτοποίηση του μικροβιακού DNA
16 Escherichia coli ( 10 positive culture) 10 Staphylococcus aureus ( 5 positive culture) 10 Staphylococcus epidermidis ( 5 positive culture) 2 Enterococcus faecalis ( 1 positive culture) 2 Streptococcus pneumoniae ( 1 positive culture) 2 Streptococcus group B 2 Streptococcus group A 2 Pseudomonas aeruginosa 1 Bacteroides fragilis + Peptostreptococcus 1 Fusobacterium 3 Kingella kingae 1 Eikenella corrodens

56 Παρουσία DNA στο κλινικό δείγμα κλινική σημασία
Νεκρά ή ζωντανά μικροβιακά κύτταρα Έλεγχος βιωσιμότητας του μικροοργανισμού (εκχύλιση RNA από το κλινικό δείγμα, RT-PCR)

57 Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο Λάρισας 2006
30 ασθενείς Gram χρώση καλλιέργεια ‘Ελεγχος για παρουσία μικροβιακού DNA βιωσιμότητα 30 ασθενείς πυοσφαίρια αρνητική 25 ασθενείς

58 Η ΣΥΜΒΟΛΗ ΤΩΝ ΜΟΡΙΑΚΩΝ ΜΕΘΟΔΩΝ ΣΤΗΝ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΤΗΣ ΜΙΚΡΟΒΙΑΚΗΣ ΑΝΤΟΧΗΣ ΗΤΑΝ ΚΑΘΟΡΙΣΤΙΚΗ η εξάπλωση της μικροβιακής αντοχής επέβαλλε τη διερεύνηση σε μοριακό πλέον επίπεδο των μηχανισμών που ευθύνονται ανίχνευση γονιδίων απευθείας στο κλινικό δείγμα

59 Panton-Valentin leukocidin gene TSST-1
Η ΣΥΜΒΟΛΗ ΤΩΝ ΜΟΡΙΑΚΩΝ ΜΕΘΟΔΩΝ ΣΤΗΝ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΠΑΡΑΓΟΝΤΩΝ ΠΑΘΟΓΟΝΙΚΟΤΗΤΑΣ Panton-Valentin leukocidin gene TSST-1 Γονιδίων που εμπλέκονται στην παραγωγή βιομεμβράνης

60 Η εξάπλωση στο νοσοκομειακό περιβάλλον
πολυανθεκτικών μικροοργανισμών επέβαλλε τη τυποποίηση αυτών ( στελέχη που συνδέονται κλωνικά μεταξύ τους έχουν κοινά χαρακτηριστικά)

61 Πλεονεκτήματα της PFGE
μέθοδος αναφοράς για διερεύνηση ενδονοσοκομειακών λοιμώξεων μεγάλη επαναληψιμότητα διαθέσιμα εμπορικά kits (Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa etc)

62

63 ΠΑΡΟΥΣΙΑ ΚΛΩΝΟΥ ΣΕ ΜΙΑ ΚΛΙΝΙΚΗ
ΜΕΤΑΔΟΣΗ ΑΠΟ ΑΣΘΕΝΗ ΣΕ ΑΣΘΕΝΗ ΛΗΨΗ ΕΙΔΙΚΩΝ ΜΕΤΡΩΝ ΠΡΟΛΗΨΗΣ ΕΝΗΜΕΡΩΣΗ-ΕΚΠΑΙΔΕΥΣΗ ΤΟΥ ΙΑΤΡΙΚΟΥ ΚΑΙ ΠΑΡΑ-ΙΑΤΡΙΚΟΥ ΠΡΟΣΩΠΙΚΟΥ

64 ΠΑΡΟΥΣΙΑ ΔΙΑΦΟΡΕΤΙΚΩΝ ΠΟΛΥΑΝΘΕΚΤΙΚΩΝ ΚΛΩΝΩΝ
ΕΥΡΕΙΑ ΚΑΤΑΝΑΛΩΣΗ ΑΝΤΙΒΙΟΤΙΚΩΝ ΑΛΛΑΓΗ ΠΟΛΙΤΙΚΗΣ ΧΡΗΣΗΣ ΑΝΤΙΒΙΟΤΙΚΩΝ

65 Πλεονεκτήματα των μοριακών τεχνικών έναντι των κλασσικών τεχνικών
Ταχύτητα στην ανίχνευση-ταυτοποίηση του λοιμογόνου παράγοντα Εφαρμογή αιτιολογικής θεραπείας Σημαντική βοήθεια στη κατανόηση της παθογένειας των λοιμώξεων

66 Μειονεκτήματα των μοριακών τεχνικών έναντι των κλασσικών τεχνικών
υψηλό κόστος ? εξειδικευμένο προσωπικό ? κατάλληλο εξοπλισμό ?

67 Αξιολόγηση του αποτελέσματος
Απαιτεί εμπειρία Συνδυασμός με τα αποτελέσματα των συμβατικών μεθόδων Επικοινωνία με τον κλινικό ιατρό

68 Μοριακή διάγνωση Φυματίωσης
Μοριακή διάγνωση Φυματίωσης Bayes’s Theorem C = (DxA) / (DxA) + (1-D) (1-B) A: Sensitivity, B: Specificity C: Positive Predictive Value (PPV), D: Disease Prevalence ΥΠΟΘΕΣΗ TB diagnostic assay with 99% Sensitivity (!!!) and 99% Specificity (!!!!) disease prevalence 1%: PPV 50% disease prevalence 10%: PPV 91% disease prevalence 20%: PPV 96%

69 Eργαστήριο Μοριακής Μικροβιολογίας, Ινστιτούτο Τεχνολογίας και Έρευνας Θεσσαλίας,
Α. Πραττή Α. Πουλτσίδης Α. Στέφος Ν. Γκατσέλης Ε. Μάλλη Δ. Κλάψα Μ. Καρανίκα Μ. Μοράβα Σ. Νικολάου, Ε. Τιγκίρογλου

70 Thank you