Η παρουσίαση φορτώνεται. Παρακαλείστε να περιμένετε

Η παρουσίαση φορτώνεται. Παρακαλείστε να περιμένετε

Κατερίνα Αναστασίου -Γιώργος Παπαδόπουλος Ειδικευόμενοι βιοπαθολoγίας Γ.Ν.Θ. «Άγιος Παύλος» Συντονίστρια: Αναστασία Βακαλούδη.

Παρόμοιες παρουσιάσεις


Παρουσίαση με θέμα: "Κατερίνα Αναστασίου -Γιώργος Παπαδόπουλος Ειδικευόμενοι βιοπαθολoγίας Γ.Ν.Θ. «Άγιος Παύλος» Συντονίστρια: Αναστασία Βακαλούδη."— Μεταγράφημα παρουσίασης:

1 Κατερίνα Αναστασίου -Γιώργος Παπαδόπουλος Ειδικευόμενοι βιοπαθολoγίας Γ.Ν.Θ. «Άγιος Παύλος» Συντονίστρια: Αναστασία Βακαλούδη

2  Σύνδεση αντιγόνου- αντισώματος Διάγνωση ευρέως φάσματος νοσημάτων:  Λοιμωδών  Αιμολυτικών  Αυτοάνοσων  Νεοπλασματικών  Ανοσοανεπαρκειών  Διαπίστωση ιστοσυμβατότητας κ.τ.λ. Ορατή Μη ορατή Βασική αρχή ανοσολογικών αντιδράσεων

3  Κύριες μέθοδοι στην εργαστηριακή διερεύνηση των αυτοάνοσων νοσημάτων  Aνοσοδιάχυση  Συγκόλληση  Ηλεκτροφόρηση  Θολωσιμετρία  Νεφελομετρία  Χρωματογραφία  Δεσμευτικές ανοσομέθοδοι -Ραδιοϊσοτοπικές μέθοδοι (RIA-ΙRMA) -Ανοσοενζυμικές μέθοδοι (EIA-ELISA) -Χημειοφωταύγεια (CHIA) -Ανοσοφθορισμός (ΙFA)  Μέθοδοι προσδιορισμού HLA  Κυτταρομετρία ροής

4  Αρχή μεθόδου  Σχέση συγκέντρωσης Ag και Ab με το σχηματισθέν ίζημα Ποσοτικές-Ποιοτικές Συγκέντρωση Ag ↑ Ag ↑ Ab Ag+AbΗμίρρευστο υλικό Γραμμή καθίζησης Χρωστική Πιο εμφανής γραμμή καθίζησης

5 Ποιοτικές Μονή ανοσοδιάχυση (υγρό μέσο ή πηκτή) Διπλή ανοσοδιάχυση (πηκτή) Διπλή ανοσοδιάχυση (πηκτή) Ποσοτικές Κυκλοτερής ανοσοδιάχυση (πηκτή) Κυκλοτερής ανοσοδιάχυση (πηκτή) Ηλετροανο- σομέτρηση (πηκτή) Ηλετροανο- σομέτρηση (πηκτή)

6  Διπλή διάχυση προς δύο κατευθύνσεις (Ouchterlony) Γραμμή καθίζησης Διάλυμα αντιγόνου Διάλυμα αντισώματος Άγαρ

7  Κυκλοτερής ανοσοδιάχυση (Mancini) Άγαρ με ενσωματωμένο αντι-IgG,A,M αντίσωμα (αντιορό) Εξεταζόμενος ορός (1,2,3,4) ορός γνωστής συγκέντρωσης IgG,A,M Διάμετρος δακτυλίου Συγκέντρωση αντιγόνου (IgG,A,M) Κυκλοτερής ανοσοδιάχυση σε πλάκα

8 Προσδιορισμός :  CRP  Ανοσοσφαιρινών  αντι-ΕΝΑ  Παραγόντων του συμπληρώματος  Διάφορων πρωτεϊνών πλάσματος διαγνωστικής σημασίας κ.α.

9  Άμεσες  Έμμεσες ή παθητικές Φυσικό επιφανειακό αντιγόνο Κύτταρο Προσροφημένο αντιγόνο Κύτταρο ή Σωματίδιο Latex Εφαρμογές:  Ερυθρά αιμοσφαίρια → Παθητική αιμοσυγκόλληση  Σωματίδια Latex → Συγκόλληση Latex Σωματιδιακό αντιγόνο + ομόλογο αντίσωμα → κροκίδες (συγκόλληση)

10 Αντιγονικές καθοριστικές ομάδες  Σχηματισμός δικτυωτού πλέγματος Fc τμήμα Ab Fab τμήμα Ab Fc τμήμα Ab Fab τμήμα Ab Προϋποθέσεις: Ικανή ισχύ Ab, σωστή αναλογία Ag/Ab, παρουσία ηλεκτρολύτη, κατάλληλη θερμοκρασία.

11  Έμμεση αιμοσυγκόλληση ΑbΑb+ Ερυθρά με προσροφημένο Ag Συγκόλληση ερυθρών Rose-Waaler test

12  Συγκόλληση Latex  Μέθοδος έμμεσης (παθητικής) συγκόλλησης  Σωματίδιο Latex: Σωματίδιο πολυστυρενίου πάνω στο οποίο έχουν προσροφηθεί μόρια αντιγόνου  Σχηματική απεικόνιση συγκόλλησης Latex Σωματίδια Latex AgLatex με αντιγόνο Latex με αντιγόνο ΑbΑb Συγκόλληση Latex

13  Άμεση Coombs Ερυθρά με προσκολλημένα IgG αντισώματα Αντι-IgG (αντι- ανθρώπινη γ-σφαιρίνη) Συγκόλληση

14  Έμμεση Coombs Φυσιολογικά ερυθρά Ορός αίματος με IgG Ab Προσκόλληση IgG στα ερυθρά Αντι-IgG (αντι-ανθρώπινη γ-σφαιρίνη) Συγκόλληση 1 ο Στάδιο2 ο Στάδιο ++

15  Πλεονεκτήματα Απλότητα, ευκολία, ταχύτητα, μικρό κόστος, μεγάλη ευαισθησία και ποικιλία αντισωμάτων προς ανίχνευση.  Μειονεκτήματα Μη ειδικές συγκολλήσεις, δυσκολίες στην ανεύρεση και συντήρηση ερυθρών αιμοσφαιρίων, φαινόμενο προζώνης.  Γίνονται σε πλάκα ή δοκιμαστικά σωληνάρια και είναι ποιοτικές ή ημιποσοτικές (τίτλος Ab).  Εφαρμογές  Ποιοτικό και ημιποσοτικό προσδιορισμό CRP, RF, anti- DNA, αντισώματα κατά φωσφολιπιδίων (αLP) κ.α.  Διάγνωση της αυτοάνοσης αιμολυτικής αναιμίας.

16  Φυσικοχημική μέθοδος διαχωρισμού πρωτεϊνών  Αρχή μεθόδου  Διαχωρισμός πρωτεϊνών με βάση τη διαφορετική (λόγω ΜΒ και φορτίου) κινητικότητα των μορίων εντός κατάλληλου υλικού, κατά την εφαρμογή ηλεκτρικού πεδίου  Υπεργαμμασφαιριναιμία  Οξείες, χρόνιες λοιμώξεις  Χρόνιες φλεγμονώδης παθήσεις  Νεοπλάσματα  Αυτοάνοσα νοσήματα

17  Ηλεκτροφόρηση ζώνης  Ηλεκτροφόρηση εντός αγαρόζης ή οξικής κυτταρίνης  PAGE (polycrilamide gel electroforesis)  Ηλεκτροφόρηση σε gel πολυακρυλαμιδίου (μοριακό διαχωριστικό μέσο) → αύξηση διαχωριστικής ικανότητας

18  SDS (sulfo dodegylic sodium)  Δωδεκυλικό Na → εκδίπλωση πρωτεϊνών, σταθερή αναλογία φορτίου/μάζας → κίνηση μορίων αντιστρόφως ανάλογη του ΜΒ  SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση  Συνδυασμός SDS και PAGE ηλεκτροφόρησης

19  Αρχή μεθόδου Ορός Αγαρόζη Διαχωρισμός πρωτεϊνών ορού Αυλάκι Αντίσωμα (Αντιορός) Διάχυση αντοορού Διάχυση πρωτεΐνης Τόξο καθίζησης Επώαση Διαδρομή ορού Ηλεκτροφόρηση + Διπλή ανοσοδιάχυση

20  Ανοσοηλεκτροφορήματα Τόξο καθίζησης φυσιολογικής πρωτεΐνης Τόξο καθίζησης μονοκλωνικής πρωτεΐνης (ανώμαλη πάχυνση ή κύρτωση) Ανίχνευση μονοκλωνικής πρωτεΐνης

21  Αρχή μεθόδου Ηλεκτροφόρηση του προς μελέτη ορού Επίστρωση αντιορού σ’ όλη την επιφάνεια ηλεκτροφόρησης Επώαση Δημιουργία ζώνης καθίζησης Χρωστική Ανοσοκαθήλωση φυσιολογικού ορού Ανίχνευση μονοκλωνικής πρωτεΐνης

22  Εφαρμογές  Κρυοσφαιρίνες  ds DNA  Μονοκλωνικές ανοσοσφαιρίνες (ΡΑ, ΣΕΛ, σύνδρομο Sjögren) κ.α Ανίχνευση μονοκλωνικής πρωτεΐνης

23  Μιας διάστασης διπλή ηλεκτροανοσοδιάχυση (counter ηλεκτροφόρηση)  Μιας διάστασης μονή ηλεκτροανοσοδιάχυση (rocket ηλεκτροφόρηση, τεχνική Laurell)  Ανοσοαποτύπωση (Western blotting)

24  Αρχή μεθόδου Ηλεκτροφορητικός διαχωρισμός βάσει ΜΒ σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση)  Μεταφορά σε ΝΚ με εφαρμογή ηλεκτρικού πεδίου  Επώαση με Αb  Επώαση με αντι-Αb ιχνηθετημένο  Ακολουθεί ανίχνευση  Ενζυμοανοσολογικά  Ραδιοϊσοτοπικά  Με χημειοφωταύγεια

25  Εφαρμογές  ENA (Sm, RNP, SSA/Ro, SSB/La, Scl70, Jo1, CENP κ.α.), dsDNA, AMA, αντι- CCP, κ.α.  Ιστόνες (Η1, Η2Α, Η2Β, Η3, Η4) κ.α.  Προσδιορισμός κρυοσφαιρινών  Πολυπεπτίδια σύνθετων Ag (Β΄,Β, D του Sm), (70kD, A, C του RNP)  Πολλά ταυτόχρονα Aabs και πολυπεπτίδια κ.α

26  Μέτρηση της απορρόφησης της ακτινοβολίας, που προκύπτει όταν δέσμη φωτός προσπίπτει σε σωματίδια μεγάλης διαμέτρου (συμπλέγματα μορίων με σωματίδια Latex, ανοσοσυμπλέγματα)

27  Μέτρηση της έντασης της σκέδασης, που προκύπτει όταν δέσμη φωτός προσπίπτει σε σωματίδια μεγάλης διαμέτρου (συμπλέγματα μορίων με σωματίδια Latex, ανοσοσυμπλέγματα)

28  Πλεονεκτήματα-Μειονεκτήματα  Ακριβής,ταχεία, εύκολη  Καλή ευαισθησία και ειδικότητα  Δυνατότητα μέτρησης χαμηλών συγκεντρώσεων (10ˉ³ - 10ˉ⁶g/L)  Αυτοματοποιημένη  Σφάλματα μετρήσεων (λιπαιμικός ορός, σκόνη, συγκρίματα πρωτεΐνών).  Εφαρμογές  Ανοσοσφαιρίνες IgG, IgM, IgA, IgE  Υποτάξεις ανοσοσφαιρινών  κ και λ αλυσίδες  C3, C4, CRP, RF  β2 μικροσφαιρίνη Συγκέντρωση πρωτεϊνών

29  Ομάδα μεθόδων για το διαχωρισμό των συστατικών ενός μίγματος, που μοιάζουν μεταξύ τους ως προς τις φυσικές και χημικές ιδιότητες, π.χ. πρωτεΐνες, αμινοξέα, σάκχαρα, βιταμίνες, φάρμακα.  Μίγματα όπως  Βιολογικά υγρά  Πλάσμα  Ούρα  Εκχύλισμα ιστών

30  Αρχή μεθόδου  Είναι σύστημα ΔΥΟ ΦΑΣΕΩΝ: σταθερής και κινητής.  Το δείγμα διοχετεύεται στην κινητή φάση ή εφαρμόζεται στη σταθερή  Η κινητή φάση ρέει κατά μήκος της σταθερής και παρασύρει το δείγμα  Ο διαχωρισμός των συστατικών του δείγματος στηρίζεται στο διαφορετικό βαθμό αντίδρασής τους με καθεμιά από τις φάσεις.

31  Χρωματογραφικές μέθοδοι  Πηκτής  Ανταλλαγής ιόντων  Υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC)  Συγγενείας  Εφαρμογές  CRP  ENA  Ανοσοσυμπλέγματα κ.α. HPLC

32  Μέθοδοι ΙΑ  RIA-IRMA  ΕΙΑ (ELISA) (10ˉ⁹ - 10ˉ¹² g/L)  CHIA-ΙCHIA  IFA Ανταγωνιστικές Μη ανταγωνιστικές Ποιοτικές-Ποσοτικές  Αρχή μεθόδου

33 Ανοσολογικές μέθοδοι όπου η ένταση του αποτελέσματος είναι αντιστρόφως ανάλογη της συγκέντρωσης της προσδιοριζόμενης ουσίας  Σχηματική απεικόνιση ανταγωνιστικής μεθόδου

34  Αρχή μεθόδου Ανοσολογικές μέθοδοι όπου η ένταση του αποτελέσματος είναι ανάλογη της συγκέντρωσης της προσδιοριζόμενης ουσίας  Σχηματική απεικόνιση μη ανταγωνιστικής μεθόδου

35  Αρχή μεθόδου Ανταγωνιστική τεχνική στην οποία χρησιμοποιούμε ραδιενεργά σημασμένο Ag το οποίο ανταγωνίζεται με το προς μέτρηση Ag για την πρόσδεση σε περιορισμένη ποσότητα του αντίστοιχου Ab

36  Αρχή μεθόδου  H προς μέτρηση ουσία δεσμεύεται από δύο Ab, ένα ραδιενεργό και ένα μη ραδιενεργό  Περισσότερο ευαίσθητη  Σχηματική απεικόνιση ΙRMA

37  Εφαρμογές  CRP, RF  Συμπλήρωμα  dsDNA, AMA, Αbs κατά φωσφολιπιδίων (aLP) κ.α.  Αντιθυρεοσφαιρινικά αντισώματα (anti-TG).  Αντισώματα έναντι της θυρεοειδικής υπεροξειδάσης (anti-TPO).  Αντιμικροσωμιακά θυροειδούς (anti-M).

38  Αρχή μεθόδου Ανίχνευση της προσδιοριζόμενης ουσίας με τη χρήση δεύτερης, ομοιοπολικά συνδεδεμένης με ένζυμο, που έχει σχέση Ag/Ab Χρωμογόνο υπόστρωμα (άχρωμο) Ένζυμο Προϊόν έγχρωμο Οπτική πυκνότητα έγχρωμου προϊόντος Φωτόμετρο Συγκέντρωση προσδιοριζόμενης ουσίας Βαθμονομημένη καμπύλη

39  Ανταγωνιστική ΕLISA  Η τελική χρωματική ένταση αντιστρόφως ανάλογη της συγκέντρωσης της προσδιοριζόμενης ουσίας  Μέθοδος εκλογής για μικρού ΜΒ ουσίες  Σχηματική απεικόνιση ανταγωνιστικής ELISA

40  Μη ανταγωνιστική (μέθοδος Sandwich) Η τελική χρωματική ένταση ανάλογη της συγκέντρωσης της προσδιοριζόμενης ουσίας  Μέθοδος εκλογής για ειδικά Ab, αυτοαντισώματα, κυτταροκίνες, ελεύθερ0υς υποδοχείς κ.α.  Πιο ευαίσθητη, λιγότερο ειδική από την ανταγωνιστική  Σχηματική απεικόνιση μη ανταγωνιστικής ELISA

41  Αυτοαντισώματα  ΑΝΑ  anti-DNA  Anti-ENA  AMA  ASMA  p-ANCA, c-ANCA  anti-GB  anti-TG, anti-TPO  RF  Αντι-CCP  Καρδιολιπίνης, φωσφολιπιδίων κ.α.  Κυτταροκίνες και διαλυτοί υποδοχείς κυτταροκινών  Παράγοντες συμπληρώματος  Ειδικά Ab, τάξης ΙgE, (μέθοδος RAST)  Μόρια προσκόλλησης, αυξητικοί παράγοντες, προσταγλανδίνες, λευκοτριένια, κυτταροτοξικά αντισώματα κ.α.

42 Ειδικό- τητα Ευαι- σθησία Επανα- ληψι- μότη- τα Κόστος Εύκο- λη χρήση Ραδιε- νεργά από- βλητα Σταθε- ρότητα αντι- δραστη- ρίων Φάσμα εφα- ρμογών ELISA≤≤CV<5%>>—>> RIA≥≥—<<><< USERIA (x1000 ευαισθησία)

43  Αρχή μεθόδου Αντί χρωμογόνων και, φθοριζόντων υποστρωμάτων χρησιμοποιούνται υποστρώματα τα οποία φωταυγάζουν, δηλαδή έχουν την ιδιότητα να μετατρέπουν μέρος της ενέργειας, από μία μεσολαβούσα χημική αντίδραση, σε φωτεινή ακτινοβολία  Αλκαλική φωσφατάση  Αποφοσφορυλίωση υποστρώματος → ασταθές προϊόν που φωταυγάζει

44  Αντισώματα έναντι εκχυλίσματος πυρηνικών αντιγόνων (anti-ENA).  Αντισώματα έναντι της διπλής έλικας DNA (anti- dsDNA).  Αντικαρδιολιπινικά αντισώματα (αCL-IgG, IgM).  Αντι-β2 γλυκοπρωτ/εϊνικά αντισ/τα (αβ2GPI-IgM, IgG).  Αντιγλοιαδινικά αντισώματα (DGP-IgG, IgA).  Αντισώματα τρανσγλουταμινάσης (anti- tTG-IgA).  Αντιθυρεοσφαιρινικά αντισώματα (anti-TG).  Αντισώματα έναντι της θυρεοειδικής υπεροξειδάσης (anti-TPO) κ.α.

45  Μεγάλη ευαισθησία  Μικρό όγκο δείγματος  Μικρό χρόνο επώασης  Σταθερά αντιδραστήρια  Πλήρως αυτοματοποιημένη μέθοδος  Μετράει φως και ευκολότερα δέχεται παρεμβολές από την ποιότητα του αίματος που αναλύεται (αιμολυμένος ή λιπαιμικός ορός).

46  Αρχή μεθόδου Ανοσοϊστοχημική τεχνική κατά την οποία το ειδικό σύμπλεγμα Ag-Ab γίνεται ορατό με τη βοήθεια Ab σημασμένου με φθοριόχρωμα στο μικροσκόπιο φθορισμού

47  Φθορίζον αντίσωμα Αντιορός έναντι της ανθρωπείου γ-σφαιρίνης ή μεμονωμένων τάξεων ανοσοσφαιρινών, σημασμένων με φθορίζουσα χρωστική

48  Φθορισμός Εκπομπή φωτός μεγαλύτερου μήκους κύματος από μια ουσία όταν αυτή ακτινοβοληθεί με φως μικρότερου μήκους κύματος.  Φθοριοχρώματα  Ισοθειακυανική φλουορεσκίνη (FITC)- πράσινη  Ισοθειοκυανική τετραμεθυλροδαμίνη (TMRITC)-κόκκινο  Φυκοερυθρίνη (PE)- πορτοκαλί  Αρχή παραγωγής φθοριοχρώματος

49  Μικροσκόπιο με προσπίπτοντα φωτισμό Προσοφθάλμιος Ηθμός φραγμού Δίκοιλο κάτοπτρο αντικειμενικός παρασκεύασμα Διεγερτικός ηθμός

50  Μικροσκόπιο με διερχόμενο φωτισμό Προσοφθάλμιος φακός Ηθμός φραγμού αντικειμενικός παρασκεύασμα πυκνωτής Διεγερτικός ηθμός

51

52  Άμεση μέθοδος  Έμμεση μέθοδος  Αρχή λειτουργίας ανοσοφθορισμού Άμεσος IFA Έμμεσος IFA Αντι-Ig Ab σημασμένο Με φθοριό- χρωμα

53  Χρώση του συμπληρώματος  Αρχή λειτουργίας χρώσης του συμπληρώματος Υπόστρωμα (Ag) +Μη σεσημασμένο Ab + Συμπλήρωμα Σεσημασμένο Ab έναντι του συμπληρώματος Φθορίζον σύμπλεγμα Αντι- C3 Ab Συμπλήρωμα

54  Διπλή φθορίζουσα χρώση Δύο αντιοροί + Δύο φθοριοχρώματα Δύο ανοσοσυμπλέγματα Ag-Ab Δύο χρώματα στη μικροσκόπηση

55  Τεχνική της μεθόδου

56  Πλεονεκτήματα  Καλή ειδικότητα, ευαισθησία  Ευκολία στην εκτέλεση  Χαμηλό κόστος  Προσδιορισμός της τάξης του αντισώματος που αντιδρά  Προσδιορίζεται το αντιγόνο στο σημείο που υπάρχει  Μειονεκτήματα  Εξειδικευμένο προσωπικό (μικροσκόπηση)  Υποκειμενική εκτίμηση του αποτελέσματος  Ημιποσοτικός προσδιορισμός  Χρονοβόρα τεχνική διαδικασία  Ανιχνεύει Ag σε κύτταρα ή μεγάλα μόρια και όχι διαλυτά Ag

57  Αποτέλεσμα  Ο τίτλος του ορού, δηλαδή η μεγαλύτερη αραίωση που δίνει θετικό αποτέλεσμα.  Το πρόβλημα….  Επαναληψιμότητα  Σύγκριση αποτελεσμάτων από εργαστήριο σε εργαστήριο -Ποικιλία υποστρωμάτων -Διαφορετικοί αντιοροί -Διαφορετικά μικροσκόπια -Διαφορετική απόδοση του μικροσκοπίου.  Η λύση  Πρότυπος ορός WHO (66/ IU/ml όριο θετικότητας 6 IU/ml)  Οπτικές πρότυπες αντικειμενοφόρες πλάκες.

58  Εφαρμογές  Ανίχνευση αυτοαντισωμάτων (ANA-screening, αντι-dsDNA, ANCA, AMA, ASMA, οργανοειδικά Ab)  Ανίχνευση ανοσοσφαιρινών και συμπληρώματος (ιστούς)  Αντιγόνα λεμφοκυττάρων, μακροφάγων,κοκκιοκυττά- ρων, ερυθρών αιμοσφαιρίων  Συστατικά ομάδων αίματος κ.α.

59  Μη οργανοειδικά αυτοαντισώματα  Έναντι του πυρήνα και της πυρηνικής μεμβράνης (ΑΝΑ)  Έναντι του κυτταροπλάσματος (ΑΜΑ, RIBA, LKM, ARA, ASMA, MF, IMF)  Ab που συνδέονται με κοιλιοκάκη (AGA, EMA)  BCLA, G-cyt, έναντι των χολαγγείων (CBA), έναντι της συσκευής Golgi, λυσοσωματίων, κεντριολίων κ.α.

60  Οργανοειδικά αυτοαντισώματα  Αντιθυρεοειδικά (TMA)  Αντιεπινεφριδικά (CSA)  Αντιπαγρεατικά (ICA)  Αντιτοιχωματικά (APCA)  Έναντι της διαφανούς ζώνης του ωαρίου, σπερματοζωαρίων, αιμοπεταλίων, ερυθροκυττάρων, υποδοχέα της ακετυλοχολίνης, μελανοκυττάρων κ.α.

61  Είδη υποστρωμάτων Α) Κύτταρα από καλλιέργειες ανθρώπινων επιθηλιακών κυττάρων  Hep-2  Hela  KB Β) Yποστρώματα οργάνων αρουραίου (ήπαρ-νεφρός- στόμαχος) Γ) Μαστιγοφόρο Crithidia luciliae (αντι-ds DNA) Αρχική αραίωση του ορού  1/80 για ΑΝΑ  1/20 για anti-DNA Σεσημασμένος αντιορός (Conjugate)  Πολυδύναμος αντιανθρώπειος ορός κονίκλου συνδεδεμένος με FITC Αποτέλεσμα  Τίτλος αυτοαντισωμάτων

62  Μορφή φθορισμού  Διάχυτος ή ομοιογενείς (diffuse,homogenous)  Στικτός ή κοκκιώδης (coarse,fine-speckled)  Περιφερικός ή δακτυλιοειδής (rim,shaggy,peripheral)  Μεμβρανώδης (membranous)  Διακριτός (Λαμπερός) στικτός (discrete speckled)  Πυρηνιδίου (nucleolar)

63 Hep-2, ΑΝΑ negative

64  Φθορισμός  Αφορά όλο το πυρηνόπλασμα με επίταση σε ορισμένες περιοχές  Αντισώματα  Έναντι ιστονών και δευτερευόντως έναντι dsDNA, ssDNA και συμπλέγματος DNA με ιστόνες.  Συσχέτιση με νόσο  Όλα τα αυτοάνοσα νοσήματα Hep-2, homo. nuclear

65  Φθορισμός  Κινητοπλάστη του Crithidia luciliae σαν δίσκος ή δακτύλιος εντονότερος του πυρήνα  Αντιγόνο  ds-DNA  Συσχέτιση με νόσο  ΣΕΛ  Άλλες ρευματοπάθειες (χαμηλός τίτλος) Crithidia Luciliae ds-DNA positive Crithidia Luciliae negative

66  Φθορισμός  Μεγάλα κοκκία σαφώς διακρινόμενα μεταξύ τους  Αντισώματα  Εκχυλιζόμενα πυρηνικά Ag ENA (SSA, SSB, nRNP, Sm, κ.α.)  Συσχέτιση με νόσο  ΣΕΛ  MCTD  Συστηματική σκλήρυνση  Sjögren´s Syndrome κ.α. Hep-2, coarse speckled

67  Φθορισμός  Μικρά κοκκία με ασαφή όρια  Αντισώματα  Εκχυλιζόμενα πυρηνικά Ag ENA (Scl-70, Jo-1)  Συσχέτιση με νόσο  Σκληρόδερμα  Πολυμυοσίτιδα/Δερματο- μυοσίτιδα  Αρτηριΐτιδα κ.α. Hep-2, fine speckled

68  Φθορισμός  Η περιφέρεια του πυρήνα εμφανίζεται σαν παχύς δακτύλιος δίνοντας την εντύπωση RBC.  Αντισώματα  dsDNA, σύμπλεγμα dsDNA- ιστονών ή πρωτεΐνες πυρηνικής μεμβράνης  Συσχέτιση με νόσο  ΣΕΛ  Άλλες ρευματοπάθειες (σε χαμηλό τίτλο) Ηep-2, perif. nuclear

69  Φθορισμός  Λεπτός φθορισμός της πυρηνικής μεμβράνης κυττάρων σε φάση ηρεμίας.  Αντισώματα  Πεπτίδια που βρίσκονται στις Α, Β, C, πρωτεΐνες της πυρηνικής μεμβράνης (lamins)  Συσχέτιση με νόσο  Νοσήματα ήπατος (πρωτοπαθή χολική κίρρωση)  Σκληρόδερμα κ.α. Hep-2, mem. nuclear

70  Α) Αντικεντρομεριδιακός (centromere specificity)  B) Άτυπος λαμπερός ή φθορισμός πολλαπλών κοκκίων / στιγμάτων του πυρήνα (atypical discrete speckled - multiple nuclear dots-MND)

71  Φθορισμός  Φάση ηρεμίας: μικρά κοκκία διάσπαρτα στον πυρήνα.  Πρόφαση: νέφος κοκκίων πάνω στα χρωματοσώματα.  Μετάφαση-Ανάφαση: κοκκία με μορφή ραβδίων (bars).  Αντισώματα  Μη ιστονική πρωτεΐνη στενά συνδεδεμένη με το κεντρομεριδιακό τμήμα του DNA.  Συσχέτιση με νόσο  Σύνδρομο CREST (49- 96%)  Raynaud  Σκληρόδερμα κ.α. Hep-2, cent. nuclear

72

73  Φθορισμός  4-20 μικρά ανοσομεγέθη κοκκία. Δεν υπάρχουν σε κύτταρα μίτωσης (δ.δ. από αντικεντρομεριδιακό).  Αντισώματα  Πρωτεΐνες στα πυρηνικά σωμάτια (nuclear bodies).  Συσχέτιση με νόσο  Πρωτοπαθή χολική κίρρωση (κυρίως με Secca)  Αδιαφοροποίητη κολλαγόνωση (με ή χωρίς πρωτοπαθή χολική κίρρωση). Hep-2, MND

74  Φθορισμός  1-4 μεγάλα, χοντρά και ανισομεγέθη κοκκία που δίνουν διάχυτο, στικτό ή περιφερικό φθορισμό σε κύτταρα ηρεμίας.  Αντισώματα  RNA ή RNA-πολυμεράση Ι των πυρηνίσκων  Συσχέτιση με νόσο  Σκληρόδερμα  Sjogren´s Syndrome  ΣΕΛ κ.α. Hep-2, nucl. nuclear

75 Hep-2, homo. nuclear + nucl. nuclear

76  Αντιγονικός στόχος  Οργανίδια  Κυτταροσκελετός  Υπόστρωμα  Ιστικές τομές οργάνων  Hep-2  Αρχική αραίωση  1:40  Σεσημασμένος αντιορός  Πολυδύναμος αντιανθρώπειος ορός κονίκλου συνδεδεμένος με φθοριόχρωμα.

77  Αντιμιτοχονδιακά (ΑΜΑ: anti-mitochodrial antibodies)  Αντιριβοσωμιακά (RIBA: ribosomal antibodies)  Αντιμικροσωμιακά (LKM: Liver kidney microsomal antibodies)  Αντισώματα έναντι της ρετικουλίνης (ARA: anti- reticular antibodies)  Αντισώματα έναντι των λείων μυϊκών ινών (ASMA: antismooth muscle antibodies)  Αντισώματα έναντι των μικροϊνιδίων (MF: micro filaments)  Αντισώματα έναντι των ενδιάμεσων ινιδίων (IMF: intermedia filaments)

78  Υπόστρωμα  Ήπαρ  Νεφρός  Στόμαχος αρουραίου. Φθορισμός: Λεπτός, κοκκιώδης, κυτταροπλασματικός, όχι καλά οργανωμένος.  Hep-2 Φθορισμός: Λεπτός κοκκιώδης, κυτταροπλασματικός, αποτελούμενος από γραμμοειδής σχηματισμούς (ακτίνες ποδηλάτου).  Αντισώματα  (Μ1-Μ9)  Συσχέτιση με νόσο  Μ2: ΠΧΚ (95%)  Μ4: Μικτές χολοστατικές ηπατοπάθειες με ή χωρίς ΠΧΚ, χρόνια αυτοάνοση ηπατίτιδα (25-30%)  ΣΕΛ, ΡΑ.

79 MSK, MitochondrialHep-2, Mitochondrial

80 Hep-2 + MSK, mem. Nuclear + mito.

81 Hep-2, AMA + cent. nuclear

82  Υπόστρωμα  Ήπαρ  Νεφρός  Στόμαχος αρουραίου Φθορισμός: Λεπτός, κοκκιώδης, πυκνός και αρκετά οργανωμένος.  Hep-2 Φθορισμός: Λιγότερο σαφής, περισσότερο πυκνός από AMA,LKM, δίνει την εντύπωση διάχυτου φθορισμού.  Αντισώματα  Τρείς υποομάδες της ριβοσωματικής πρωτεΐνης P (P0,P1,P2)  Συσχετισμός με νόσους  ΣΕΛ (με προσβολή ΚΝΣ, ψύχωση)  ΡΑ  Χρόνια ενεργό αυτοάνοση ηπατίτιδα.

83 MSK, Ribosomal, 20x MSK, Ribosomal Hep-2, Mitochondrial HEp-2, Ribosomal

84  Υπόστρωμα  Ήπαρ  Νεφρός  Στόμαχος αρσενικού αρουραίου και άλλων ζώων. Φθορισμός: νεφρικών σωληναρίων και αγκύλης του Henle στη φλοιώδη μοίρα του νεφρού.  Αντισώματα  Πρωτεΐνη της έσω επιφάνειας των σωληναρίων του λείου ενδοπλασματικού δικτύου.  Συσχετισμός με νόσους  LKM1: Χρόνια αυτοάνοση ηπατίτιδα  LKM2: Ηπατίτιδα από φάρμακα  LKM3: Χρόνια αυτοάνοση ηπατίτιδα.

85 MSK, LKM Microsomes

86  Υπόστρωμα  Ήπαρ  Νεφρός  Στόμαχος αρουραίου Φθορισμός: Λεπτές, σπειροειδείς, διακεκομμένες ή συνεχείς φθορίζουσες ίνες.  Αντισώματα  Γλυκοπρωτεΐνη του συνδετικού ιστού  Συσχετισμός με νόσους  Rs, R2: Νόσους του συνδετικού ιστού (Crohn, ερπητική δερματίτιδα, σύνδρομο δυσαπορρόφησης), φυσιολογικά άτομα.  R1: Κοιλιοκάκη, ερπητική δερματίτιδα, Crohn.

87 MSK, Reticuline

88  Υπόστρωμα  Ήπαρ  Νεφρός  Στόμαχος αρουραίου Φθορισμός: Λείες μυϊκές ίνες αγγείων νεφρού, ήπατος, ενδιάμεσα ινίδια και βλεννογόνια μυϊκή στοιβάδα στομάχου.  Αντισώματα  Πρωτεΐνες του κυτταροσκελετού: ακτίνη (SMAT, SMAG), μυοσίνη, τροπομυοσίνη, βιμεντίνη κ.α.(SMA-V).  Συσχετισμός με νόσους  SMAT-G: Χρόνια αυτοάνοση ηπατίτιδα, Πρωτοπαθή χολική κίρρωση  SMA-V: Χρόνιες ηπατοπάθειες, ιογενείς λοιμώξεις, καρκινοπαθείς κ.α.

89 MSK, smooth muscle

90  Υπόστρωμα  Hep-2 Φθορισμός: Κυτταροπλασματικός με γραμμώσεις επιμήκεις και παράλληλες μεταξύ τους (γρατζουνιά γάτας)-MF. Κυτταροπλασματικός αραχνοειδής με κυματοειδής γραμμώσεις εν ίδει δικτύου-IMF.  Αντισώματα  MF: Ακτίνη  IMF: Πρωτεΐνες του κυτταροσκελετού ( βιμεντίνη, δεσμίνη, κερατίνη κ.α  Συσχετισμός με νόσους  MF: Χρόνια αυτοάνοση ηπατίτιδα, πρωτοπαθή χολική κίρρωση.  IMF: Οξεία και χρόνια ηπατίτιδα, πρωτοπαθή χολική κίρρωση, ΡΑ, ιώσεις κ.α.

91 Hep-2, microfilamentsHep-2, microfilament+intermedia filaments

92  Υπόστρωμα  Ουδετερόφιλα πολυμορφοπύρηνα μονιμοποιημένα με αιθανόλη Φθορισμός:  cANCA (cytoplasmatic or classical): λεπτός στικτός φθορισμός του κυτταροπλάσματος  pANCA (perinuclear): περιπυρηνικός ή και πυρηνικός φθορισμός.  Αντισώματα  cANCA: Πρωτεϊνάση 3 (PR3)  pANCA: Μυελοϋπεροξειδάση (MPO), ελαστάση, λυσοζύμη κ.α.  Συσχετισμός με νόσους  cANCA: Κοκκιωμάτωση Wegener (75-90%)  pANCA: Μικροσκοπική πολυαγγειΐτιδα (50-75%), σύνδρομο Churg-Strauss (40-60%), σπειραματονεφρίτιδα κ.α.

93 cANCApANCA

94 cANCA + ANA

95  Υπόστρωμα  Στόμαχος ανθρώπου, ποντικού ή αρουραίου. Φθορισμός: Κυτταροπλασματικός, πυκνός, των τοιχωματικών κυττάρων των γαστρικών αδένων.  Αντισώματα  Λιποπρωτεΐνη των μικροσωμάτων.  Συσχετισμός με νόσους  Κακοήθη αναιμία (90-95%), δ.δ. από άλλες μεγαλοβλαστικές αναιμίες  Ατροφική γαστρίτιδα, γαστρικά έλκη  Νόσος του θυρεοειδούς  Νόσος του Addison  Διαβήτη τύπου 1  Σιδηροπενική αναιμία  Λεύκη  Υγιή πληθυσμό- Υπερήλικες (8%)

96 MSK, parietal cells

97  CRP  Μέθοδος συγκόλλησης Latex  Απλή ακτινωτή ανοσοδιάχυση  Ηλεκτροανοσοδιάχυση  Ραδιοανοσολογική μέθοδος (RIA)  Νεφελομετρία κ.α.  RF  Μέθοδος συγκόλλησης Latex  Ανοσοενζυμική (ELISA)  Ραδιοανοσολογική (RIA)  Νεφελομετρία κ.α.

98  Συμπλήρωμα  Ραδιοανοσολογική μέθοδος (RIA)  Θολωσιμετρία  Νεφελομετρία  Ανοσοσυμπλέγματα (αδιάλυτα μεγαλομοριακά συμπλέγματα αντιγόνου- αντισώματος που καθιζάνουν στους ιστούς και προκαλούν βλάβες)  Χρωματογραφία  Ηλεκτροφόρηση  Ανοσοενζυμική μέθοδος (ΕLISA) κ.α.

99  Κρυοσφαιρίνες Ανοσοσφαιρίνες που καθιζάνουν σε χαμηλή θερμοκρασία.  Σύνδρομο Sjögren (τύπος ΙΙ)  Αυτοάνοσα νοσήματα (τύπος ΙΙΙ)  Προσδιορισμός Ποσοτικά:  Με κρυοκρίτη α) V ιζήματ0ς/ V ολικό % β) Ολική πρωτείνη ορού προ και μετά την καθίζηση Ποιοτικά:  Ανοσοηλεκτροφόρηση  Ανοσοκαθήλωση  Ανοσοαποτύπωση

100

101

102  dsDNA (ΣΕΛ)  IFA (Crithidia lucilliae, ειδική αλλά όχι πολύ ευαίσθητη)  RIA υγρής φάσης (μέθοδος αναφοράς)  ELISA  Ανοσοαποτύπωση  Ανοσοκαθήλωση  ENA Sm (ΣΕΛ) nRNB (ΜΝΣΙ) SS-A(RO), SS-B (LA) (Sgögren) Scl-70 (σκληρόδερμα) Jo-I (πολυμυοσίτιδα)  IFA (ΑΝΑ θετικά + τύπος φθορισμού)  ELISA  Χρωματογραφία  Ανοσοαποτύπωση

103  ANCA pANCA cANCA (κοκκιωμάτωση Wegener)  IFA (περιπυρηνικός ή κυτταροπλασματικός)  ΕLISA (anti-MPO ή anti- PR3)  AMA (ΠΧΚ)  IFA  ELISA  Ανοσοαποτύπωση  RIA

104  Abs κατά φωσφολιπιδίων (aPL) (αντιφοσφωλιπιδικό σύνδρομο,ΣΕΛ)  RIA  ELISA  Δοκιμασίες πήξεως (αντιπηκτικό του λύκου)  Συγκολλητινοαντιδράσεις (VDRL)

105

106 Αρνητική αντίδραση Μη λύση κυττάρων (Μικρά, λαμπερά, ακτινοβόλα κύτταρα) Θετική αντίδραση Λύση κυττάρων (Μεγάλα, σκοτεινά, μη ακτινοβόλα κύτταρα)  Μικρολεμφοκυτταροτοξική μέθοδος Kύτταρα +Αντιορούς (αντι-HLA γνωστής ειδικότητας) ΣυμπλήρωμαΣύμπλεγμα Ag-Ab ??? + Επώαση Εωσίνη

107

108  Tεχνική κατά την οποία ένα γονίδιο ή τμήμα του DNA πολλαπλασιάζεται σε εκατομμύρια αντίγραφα.  PCR-SSP (SSP=Sequence Specific Primers)  PCR-SSOP (SSOP=Sequence Specific Oligonucleotides Probes )  PCR-SBT (Sequencing Based Typing)

109  In vitro ενζυματική αντίδραση  Ανήκει στις μεθόδους ανίχνευσης του DNA μέσω πολλαπλασιασμού του στόχου  Τελικός σκοπός της αντίδρασης είναι ο εκθετικός πολλαπλασιασμός ενός τμήματος DNA που αποτελεί το στόχο της αντίδρασης  Εκμεταλλεύεται την in vivo δράση του ενζύμου DNA πολυμεράση που διαβάζει το μονόκλωνο DNA και έχοντάς το ως πρότυπο συνθέτει συμπληρωματική άλυσο DNA παρουσία τριφωσφορικών δεοξυριβονουκλεοτιδίων.

110  Tα πολλαπλασιασμένα τμήματα του DNA, διαχωρίζονται με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης  Tο προϊόν της ηλεκτροφόρησης γίνεται ορατό ύστερα από έκθεση σε υπεριώδη ακτινοβολία με την προσθήκη χρωστικής Ethidium Bromide και αποτυπώνεται σε φωτογραφικό χαρτί.  Με βάση ειδικούς πίνακες ανάγνωσης ή προγράμματα Η/Υ (software) εξάγεται το τελικό αποτέλεσμα Εφαρμογές  τυποποίηση HLA τάξης Ι και ΙΙ γονιδίων  προσδιορισμός αλληλομόρφων διαφόρων γονιδίων

111  Μονές άλυσοι DNA με συμπληρωματική αλληλουχία νουκλεοτιδίων έχουν την τάση να συνδέονται (υβριδίζονται) και να σχηματίζουν δίκλωνο DNA.  Στο φαινόμενο αυτό στηρίζεται η ανίχνευση τμημάτων DNA γνωστής αλληλουχίας.  Ο υβριδισμός συνήθως συνδυάζεται με PCR για την ανίχνευση γνωστών γονιδίων.

112  Πολλαπλασιασμός συγκεκριμένων τμημάτων των γονιδίων που θέλουμε να μελετήσουμε με PCR  Ανίχνευση του προϊόντος με υβριδισμό με ολιγονουκλεοτιδικούς ανιχνευτές σημασμένους (oligonucleotide probes)

113  Χρησιμοποιούνται:  Εκκινητής (primer), μονή άλυσος ολιγονουκλεοτιδίων συμπληρωματική του αρχικού τμήματος  Μίγμα νουκλεοτιδίων deoxynucleotide  Λίγα dideoxynucleotide  Τα dideoxy- μπορούν να συνδεθούν αλλά διακόπτουν την επιμήκυνση της αλύσου

114  Πραγματοποιούνται παράλληλα τέσσερις διαφορετικές αντιδράσεις αντιγραφής της αλληλουχίας  Κάθε μια περιέχει ένα διαφορετικό ddNTP (αλλά όλα τα dΝΤP), καθένα εκ των οποίων είναι σημασμένο  Προκύπτει ένα μίγμα από σημασμένες αλυσίδες διαφόρων μεγεθών, που τελειώνουν με ένα ddNTP στο 3΄άκρο

115  Γίνεται ηλεκτροφόρηση και λήψη αποτυπώματος σε φίλμ  Ειδικά software, δίδουν σε σύντομο χρονικό διάστημα το αποτέλεσμα  Σήμερα χρησιμοποιούνται συστήματα αυτόματης ανάλυσης της άγνωστης νουκλεοτιδικής αλληλουχίας

116  Στόχος  Ανίχνευση  Μέτρηση  Αναγνώριση  Ταυτοποίηση  Διαλογή κυττάρων και άλλων σωματιδίων Σκέδαση Πληροφορική Μονοκλωνικά Αb φθορισμός

117  Διαγραμματική απεικόνιση κυτταρομετρίας ροής

118  Τυποποίηση HLA.  Η οξεία φάση των αυτοάνοσων νοσημάτων χαρακτηρίζεται κατά κανόνα απο αύξηση της αναλογίας των CD4+ / CD8+ Τ- λεμφοκυττάρων.  Η διαταραχή των Τ-λεμφοκυττάρων παρέρχεται μετά τη χορήγηση κατάλληλης ανοσοκατασταλτικής θεραπείας.  Η μείωση των CD8+ Τ-λεμφοκυττάρων σχετίζεται με την κλινική βαρύτητα της νόσου.  Ο CD19+ και ο CD5+ υποπληθυσμός των Β-λεμφοκυττάρων θεωρείται υπεύθυνος για την παραγωγή των αυτοαντισωμάτων.

119  Ποσοτική κυτταρομετρία  Προσδιορισμός συγκέντρωσης διαλυτών ουσιών  Απομόνωση και παραλαβή καθαρών κυτταρικών πληθυσμών κ.α.

120  Proteomics technologies  Καταγραφή ενός στιγμιότυπου του κυττάρου σε δεδομένη χρονική στιγμή.  Έλεγχος της έκφρασης, λειτουργίας και αλληλεπίδρασης πρωτεϊνών και γονιδίων στους πάσχοντες ιστούς, στους οποίους άλλα γονίδια ενεργοποιούνται και άλλα αδρανοποιούνται σε σχέση με τους φυσιολογικούς ιστούς.

121 Νομίζουμε ότι τα ´χουμε δει όλα ??? Οι εργαστηριακές τεχνικές εξελίσσονται……..

122  Μ. Μπούρα και συν.: Κλινική Ανοσολογία,2011.  Α. Γερμενής: Ιατρική Ανοσολογία.  BIORAD: Image Atlas.  Ε. Δίζα-Ματαυτσή: Αυτοαντισώματα και Νοσήματα του συνδετικού ιστού,  Σ.Δ.Ι. Δρυγιαννάκης, Χρ. Ι. Καλλούδη-Αντωνοπούλου: Τα αυτοαντισώματα στην καθ’ημέρα κλινική πράξη,  Γ. Κυριαζής: Ανοσοδιάγνωση. Γενικές αρχές. Σεμινάριο Ανοσολογίας, Ελληνική Εταιρεία Ανοσολογίας,  Αbul K. Abbas, Andrew H. Lichtman: Βασική ανοσολογία, 2004  Μικροβιολογικά χρονικά,  Μ. Παυλάτου: Ανοσολογία, 1997.

123 1. Ποιο από τα παρακάτω δεν ισχύει για τη μη ανταγωνιστική ELISA; α) Η ένταση του αποτελέσματος είναι ανάλογη της συγκέντρωσης της προσδιοριζόμενης ουσίας β) Αποτελεί μέθοδο εκλογής για τον προσδιορισμό αυτοαντισωμάτων γ) Το αποτέλεσμα επηρεάζεται από την ποιότητα του αίματος που αναλύεται (λιπαιμικός ή αιμολυμένος ορός) 2. Ποια από τα παρακάτω ισχύουν στη μέθοδο ανοσοαποτύπωσης Western blot; α) Γίνεται ηλεκτροφορητικός διαχωρισμός των πρωτεϊνών με SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση β) Η ανίχνευση του αντισώματος μπορεί να γίνει ανοσοενζυμικά γ) Βρίσκει εφαρμογή στην ανίχνευση των SSA/Ro αντισωμάτων δ)Το α και το γ ε) Όλα τα παραπάνω 3. Για την κυτταρομετρία ροής δεν ισχύει: α) Βρίσκει εφαρμογή στην τυποποίηση των HLA β) Συνδυάζει τις αρχές σκέδασης και φθορισμού γ) Στηρίζεται μόνο στην αρχή της σκέδασης δ) Χρησιμεύει στη μελέτη της πορείας των αυτοάνοσων νοσημάτων

124 4) Τι από τα παρακάτω δεν ισχύει: α) Φθορίζον αντίσωμα στον ανοσοφθορισμό είναι αντιορός έναντι της ανθρωπείου γ-σφαιρίνης σημασμένης με φθοριόχρωμα β) Φθορισμός είναι η εκπομπή φωτός μικρότερου μήκους κύματος από μία ουσία όταν αυτή ακτινοβοληθεί με φως μεγαλύτερου μήκους κύματος γ) Το φθοριόχρωμα που συνήθως χρησιμοποιείται στον ανοσοφθορισμό είναι η ισοκυανική φλουορεσκίνη (FITC) 5) Η παρακάτω εικόνα του ανοσοφθορισμού σχετίζεται με : α) ΑΜΑ β) dsDNA γ) ASMA δ) Κανένα από τα παραπάνω

125 6) Η παρακάτω εικόνα ανοσοφθορισμού σχετίζεται με : α) APCA β) ΑΜΑ γ) Κεντρομεριδίου δ) Τα α και β ε) Τα β και γ 7) Η παρακάτω εικόνα ανοσοφθορισμού σχετίζεται με : α) Φθορισμό κεντρομεριδίου β) Σύνδρομο CREST γ) Φθορισμό πυρηνιδίου δ) Τα α και β ε) Τα β και γ


Κατέβασμα ppt "Κατερίνα Αναστασίου -Γιώργος Παπαδόπουλος Ειδικευόμενοι βιοπαθολoγίας Γ.Ν.Θ. «Άγιος Παύλος» Συντονίστρια: Αναστασία Βακαλούδη."

Παρόμοιες παρουσιάσεις


Διαφημίσεις Google