ΑΝΟΣΟΛΟΓΙΑ 1/30-9-2015 Κ. ΓΑΪΤΑΝΑΚΗ Ι. ΓΕΝΙΚΗ ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΙΙ. ΒΟΗΘΗΜΑΤΑ-ΣΥΓΓΡΑΜΜΑΤΑ ΙΙΙ. ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ IV. ΑΝΟΣΟΛΟΓΙΚΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ: ΑΡΧΕΣ ΤΩΝ ΜΕΘΟΔΩΝ,

Παρουσίαση με θέμα: "ΑΝΟΣΟΛΟΓΙΑ 1/30-9-2015 Κ. ΓΑΪΤΑΝΑΚΗ Ι. ΓΕΝΙΚΗ ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΙΙ. ΒΟΗΘΗΜΑΤΑ-ΣΥΓΓΡΑΜΜΑΤΑ ΙΙΙ. ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ IV. ΑΝΟΣΟΛΟΓΙΚΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ: ΑΡΧΕΣ ΤΩΝ ΜΕΘΟΔΩΝ,"— Μεταγράφημα παρουσίασης:

1 ΑΝΟΣΟΛΟΓΙΑ 1/30-9-2015 Κ. ΓΑΪΤΑΝΑΚΗ Ι. ΓΕΝΙΚΗ ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΙΙ. ΒΟΗΘΗΜΑΤΑ-ΣΥΓΓΡΑΜΜΑΤΑ ΙΙΙ. ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ IV. ΑΝΟΣΟΛΟΓΙΚΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ: ΑΡΧΕΣ ΤΩΝ ΜΕΘΟΔΩΝ, ΕΥΡΟΣ ΕΥΑΙΣΘΗΣΙΑΣ 1

2 Αντιγόνο-Αντίσωμα Αg: Ουσία που αναγνωρίζεται ως ξένη όταν χορηγηθεί σε έναν οργανισμό Ab: Γλυκοπρωτεϊνη που παράγεται έναντι του αντιγόνου

3 ΣΧΕΣΗ Ag-Ab 3 AgAb

4 ΑΝΤΙΓΟΝΑ: αναγνώριση από υποδοχέα Β ή από υποδοχέα Τ + ΜΗC μόρια Β-κύτταρο + αντιγόνο Τ-κύτταρο + αντιγόνο Δραστικό Β-κύτταρο Β-κύτταρο μνήμης Δρατσικό Τ-κύτταρο Τ-κύτταρο μνήμης πλασματοκύτταρο CTL, Th, κλπ (εκκρίνουν κυτταροκίνες & κυτταροτοξικούς παράγοντες) (εκκρίνει αντισώματα) 4

5  15-22 αμινοξέα του ag συνδέονται με το ab  σύνδεση με δεσμούς Η +, ιοντικές και υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις, van der Walls (για ισχυρή αλληλεπίδραση απαιτείται μεγάλος αριθμός) Αλληλεπίδραση αντισώματος-αντιγόνου (μη ομοιοπολικές αλληλεπιδράσεις) υπερμτβλ περιοχές = συμπληρωματικές καθοριστικές περιοχές (complementarity- determining regions, CDRs) ΚΑΙ επίτοπος μτβλ περιοχή ελαφριάς αλυσίδας μτβλ περιοχή βαριάς αλυσίδας Είδη επιτόπων:  πολλαπλοί επίτοποι στο ίδιο αντιγόνο  ανοσοεπικρατούντες ή κυρίαρχοι  μη αλληλοεπικαλυπτόμενοι  αλληλοεπικαλυπτόμενοι  γραμμικοί ή συνεχείς  διαμορφωτικοί  κρυπτικοί 5

6 Αντιδράσεις καθίζησης (κατακρήμνισης, precipitation ) (ab δισθενές+ag δι-/πολυ-σθενές  πλέγμα  ίζημα) σε υγρό μέσο σε πήκτωμα αγαρόζης Αντιδράσεις συγκόλλησης (σχηματισμός κροκίδων, agglutination ) άμεση έμμεση ή παθητική ανασταλτική Αντιδράσεις με τη χρησιμοποίηση επισημασμένου αντιγόνου ή αντισώματος RIA ELISA-ELISPOT Western blotting,Ανοσοκατακρήμνιση Ανοσοφθορισμός-Κυτταρομετρία ροής Αντιδράσεις του συμπληρώματος Μέθοδοι προσδιορισμού των HLA αντιγόνων ΤΥΠΟΙ ΑΝΟΣΟΑΝΤΙΔΡΑΣΕΩΝ 6

7 μονοκλωνικά, πολυκλωνικά αντισώματα ανασυνδυασμένα πεπτίδια Ευχρηστία Αυτοματισμός αυξημένη ευαισθησία αυξημένη ειδικότητα αυξημένη αξιοπιστία σε όλα τα επίπεδα Η ανάπτυξη και η αναβάθμιση του υλικο-τεχνικού εξοπλισμού: - Μηχανικές, ηλεκτρονικές, μεγάλης ακρίβειας αναλώσιμου ρύγχους, (πολυκάναλες ή μη) πιπέτες - Ανοικτά ανοσολογικά συστήματα (robotic pippeting, washer, reader) - Αυτόματα ανοσολογικά συστήματα (combining incubation, washing and reading) Πλήρως αυτοματοποιημένα συστήματα Μεγάλος αριθμός δειγμάτων Ασφάλεια και Ακρίβεια Επαναληψιμότητα και αξιοπιστία Εκτυπώσιμα αποτελέσματα Επεξεργασία αποτελεσμάτων Ηλεκτρονική μεταφορά δεδομένων ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ 7

8 ΔοκιμασίαΕυαισθησία (μg Ab/ml) Κατακρήμνιση σε διάλυμα20-200 Κατακρήμνιση σε πήκτωμα Μancini Ouchterlony 10-50 20-200 Ανοσοηλεκτροφόρηση Rocket ηλεκτροφόρηση 20-200 2 Αντιδράσεις συγκόλλησης Άμεση Παθητική Ανασταλτική 0.3 0.006-0.06 RIA0.0006-0.006 ELISA ELISA με χημειοφωταύγεια ~0.0001-0.01 ~0.00001-0.01 Ανοσοφθορισμός1 Κυτταρομετρία ροής0.006-0.06 ΕΥΑΙΣΘΗΣΙΑ ΑΝΟΣΟΑΝΤΙΔΡΑΣΕΩΝ 8

9 ΤΥΠΟΙ ΑΝTIΔΡΑΣΕΩΝ ΚΑΤΑΚΡΗΜΝΙΣΗΣ σε υγρό μέσο σε πήκτωμα απλή ανοσοδιάχυση (προς μία κατεύθυνση) διπλή ανοσοδιάχυση (προς δύο κατευθύνσεις-Ouchterlony) κυκλοτερής ή ακτινωτή ανοσοδιάχυση (Mancini) ανοσοηλεκτροφόρηση-ηλεκτροφόρηση rocket 9

10 ΑΝΟΣΟΔΙΑΧΥΣΗ ΣΕ ΠΗΚΤΩΜΑ ΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟΣ ΙΖΗΜΑΤΟΣ-ΖΩΝΗ ΙΣΟΔΥΝΑΜΙΑΣ Mancini Ouchterlony 10

11 ΑΝΟΣΟΔΙΑΧΥΣΗ ΣΕ ΠΗΚΤΩΜΑ Mancini Ouchterlony σχμ δακτυλίου σχμ τόξων κατακρήμνισης 11

12 ΑΝΟΣΟΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ (ηλεκτροφόρηση κ διπλή ανοσοδιάχυση) διαχωρισμός αντιγόνων, αντιορός στην αύλακα, διάχυση κ’ κατακρήμνιση Μονοκλωνικές ανοσοσφαιρίνες αποτελούνται από βαριές και/ ή ελαφρές αλυσίδες ( 5 κατηγορίες βαριών: γ στην IgG, α στην IgA, μ στη IgM, δ στη IgD και ε στην IgΕ). Ελαφριές αλυσίδες  κ & λ. Ανοσοηλεκτροφόρηση = ποιοτική μέθοδος [συνδυασμός ηλεκτροφόρησης και ανοσοδιάχυσης] = αντιγονικές πρωτεΐνες διαχωρίζονται ~ φορτίο σε πήκτωμα αγαρόζης, ακολουθεί ταυτοποίηση μέσω ανοσοκατακρήμνισης με αντιορούς (ταυτοποίηση μονοκλωνικής πρωτεΐνης και καθορισμός του τύπου των ελαφριών και βαριών αλυσίδων) ΑΝΟΣΟΑΝΕΠΑΡΚΕΙΕΣ-ΑΝΟΣΟΫΠΕΡΠΛΑΣΤΙΚΕΣ ΑΝΩΜΑΛΙΕΣ >>ελαφριές αλυσίδες - νεφρική ανεπάρκεια, εναπόθεση ινιδίων αμυλοειδούς κ καταστροφή στα εγγύς σωληνάρια ή στο σπείραμα  ιζηματική νόσος ελαφριών αλυσίδων. Το 90% των ασθενών με πολλαπλούν μυέλωμα εμφανίζουν >> πρωτεΐνη στον ορό ή στα ούρα κατά τη διάγνωση. Τμήματα βαριών αλυσίδων καθώς και ελεύθερες ελαφριές αλυσίδες παρατηρούνται στα ούρα ασθενών με πολλαπλούν μυέλωμα ή αμυλοείδωση. Οι ανοσοσφαιρίνες IgD και IgΕ δε μπορούν να ανιχνευθούν γιατί βρίσκονται σε χαμηλές συγκεντρώσεις και δε σχηματίζουν ίζημα. 12

13 κωνοειδής ηλεκτροφόρηση: ποσοτικός προσδιορισμός αντιγόνων (κώνοι κατακρήμνισης) pH  ab ακίνητο + ag φορτίζεται (-) Κωνοειδείς κατακρημνίσεις με ύψος ~ [ag] {ab >>>> ισοηλ. σημείο /// αλκαλικό pH ab-ουδέτερο vs. αg (-) } ROCKET ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ 13

14 Ανοσοκαθήλωση = ποιοτική μέθοδος (50 φορές πιο ευαίσθητη vs ανοσοηλεκτροφόρηση). Διαχωρισμός πρωτεϊνών ~ φορτίο σε πήκτωμα αγαρόζης & ταυτοποίηση ανοσοκαθήλωσης χρησιμοποιώντας ειδικούς μονοδύναμους αντιορούς  επιτυγχάνεται η ταυτοποίηση της μονοκλωνικής πρωτεΐνης και ο καθορισμός του τύπου των ελαφριών και βαριών αλυσίδων. Η μέθοδος αυτή ενδείκνυται ιδιαίτερα σε περιπτώσεις που πρέπει να ανιχνευθούν εξαιρετικά χαμηλές συγκεντρώσεις ανοσοσφαιρινών όπως για παράδειγμα σε μυέλωμα Bence Jones τύπου IgD και IgE, σε αμυλοείδωση, μονήρες πλασμοκύττωμα καθώς και στη διάγνωση υποτροπών μετά από μεταμόσχευση μυελού των οστών. Η ανοσοκαθήλωση είναι ταχύτερη, πιο ευαίσθητη και ευκολότερη στην ερμηνεία από την ανοσοηλεκτροφόρηση. Αντιθέτως, η ανοσοηλεκτροφόρηση είναι ευκολότερη από τεχνικής άποψης και λιγότερο δαπανηρή από την ανοσοκαθήλωση. Η υψηλή αναλυτική ευαισθησία της ανοσοκαθήλωσης έχει ως αποτέλεσμα να ανιχνεύεται υψηλότερο ποσοστό κλινικά ασχέτων ευρημάτων τα οποία μπορεί να οδηγήσουν σε επιπλέον διαγνωστική διερεύνηση. Ανοσοκαθήλωση ορού ασθενούς με μυέλωμα τύπου IgM λ ΑΝΟΣΟΚΑΘΗΛΩΣΗ 14

15 Μακροσφαιριναιμία Waldenstrom Κλινική Χρησιμότητα Επιτρέπει τη διαφορική διάγνωση μεταξύ μονοκλωνικής, δικλωνικής και ολιγοκλωνικής γαμμα- σφαιρινοπάθειας Επιτρέπει την ανίχνευση ανοσοσφαιρινών που βρίσκονται σε πολύ χαμηλές συγκεντρώσεις στον ορό Μεταβολές Πολλαπλούν μυέλωμα Μακροσφαιριναιμία του Waldenström Αμυλοείδωση Λεμφοϋπερπλαστικές νόσοι 15

16 ΑΝΤΙΔΡΑΣΕΙΣ ΣΥΓΚΟΛΛΗΣΗΣ (σχμ κροκίδων) ΑΝΤΙΣΩΜΑ ΜΕ ΜΕΓΑΛΥΤΕΡΗ ΙΣΧΥ ΣΥΝΔΕΣΗΣ ΣΕ ΣΧΕΣΗ ΜΕ ΤΙΣ ΑΠΩΘΗΤΙΚΕΣ ΔΥΝΑΜΕΙΣ ΜΕΤΑΞΥ ΤΩΝ ΣΩΜΑΤΙΔΙΩΝ ΑΝΤΙΓΟΝΟΥ ΚΑΤΑΛΛΗΛΗ ΑΝΑΛΟΓΙΑ ΑΝΤΙΓΟΝΟΥ-ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΟΣ ΠΑΡΟΥΣΙΑ ΗΛΕΚΤΡΟΛΥΤΗ Τύποι αντιδράσεων ( ευαίσθητες, απλές, οικονομικές ) άμεση συγκόλληση (πχ. τυποποίηση ομάδων αίματος) έμμεση ή παθητική συγκόλληση (για διαλυτά Αg, με σωματίδια latex, πχ. μέθοδος Coombs) ανασταλτική συγκόλληση (πχ. test εγκυμοσύνης, ένδειξη/ανίχνευση χρήσης απαγορευμένων ουσιών [κοκαΐνης, ηρωίνης]) 16

17 COOMBS COOMBS Π.χ. αιμολυτική αναιμία Π.χ. μεταγγίσεις 17

18 ανίχνευση ερυθροποιητίνης [ολυμπιάδα 2004] ΑΝΑΣΤΟΛΗ ΣΥΓΚΟΛΛΗΣΗΣ 18

19 ΑΝΤΙΔΡΑΣΕΙΣ ΜΕ ΧΡΗΣΗ ΕΠΙΣΗΜΑΣΜΕΝΩΝ ΑΝΤΙΓΟΝΩΝ Η΄ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΩΝ Η επισήμανση γίνεται με μόρια που επιτρέπουν την εύκολη ανίχνευση και μέτρησή τους [RIA, ELISA – ELISPOT, ανοσοστύπωμα Western, ανoσοφθορισμός – κυτταρομετρία ροής ] ΜΕΘΟΔΟΣ RIA (radioimmunoassay) Π.χ. ανίχνευση ιού ηπατίτιδας Β 1960: Rosalyn Yalow, Solomon Aaron Berson (Bronx Veterans Administration Hospital / Mount Sinai School of Medicine) 1977 Rosalyn ! Nobel Prize Ιατρικής (RIA ινσουλίνης)Rosalyn YalowSolomon Aaron BersonMount Sinai School of Medicine Γνωστή ποσότητα αντιγόνου καθίσταται ραδιενεργή (ιώδιο σε κατάλοιπα τυροσίνης) Ακολουθεί ανάμιξη με κατάλληλο αντίσωμα  σύμπλοκο Προστίθεται δείγμα ορού (κρύο αντιγόνο) και αντικαθιστά το ραδιενεργό Μέτρηση ελεύθερου αντιγόνου στο υπερκείμενο ΑΞΙΟΣΗΜΕΙΩΤΗ ΕΥΑΙΣΘΗΣΙΑ ΥΨΗΛΗ ΕΙΔΙΚΟΤΗΤΑ ΑΝΤΑΓΩΝΙΣΜΟΣ ΜΕ ΤΟ ΡΑΔΙΕΝΕΡΓΑ ΣΗΜΑΣΜΕΝΟ ΑΝΤΑΓΩΝΙΣΤΗ ΤΟΥ ΓΙΑ ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΕΝΟ ΠΟΣΟ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΟΣ 19

20 ELISA ( ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) με αντίσωμα υψηλότερη αρχική συγκέντρωση αντιγόνου  χαμηλότερη απορρόφηση Χημειοφωταύγεια >>>> ευαισθησία 20

21 ELISPOT ΑΝΟΣΟΣΤΥΠΩΜΑ WESTERN Πήκτωμα επιστοίβαξης (ακρυλαμίδη) pH 6.8 συγκέντρωση των πρωτεϊνών σε μια γραμμή εκκίνησης Πήκτωμα διαχωρισμού pH 8.8 διαχωρισμός πρωτεϊνών ανάλογα με το ΜΒ τους και τη δομή τους SDS-PAGE ανίχνευση ενεργοποιημένων κυττάρων (ανσ-θεραπείας π.χ. αντικαρκινικό εμβόλιο  προσδιορισμός βελτιωμένης αντιγονοπαρουσίασης-έκκρισης ιντφν-γ) αναγωγή στο σύνολο των κυττάρων που εξετάστηκαν 21

22 ΑΝΑΛΥΣΗ ΚΑΤΑ WESTERN 22

23 Επώαση με το πρώτο αντίσωμα και δέσμευσή του με το αντιγόνο Επώαση με το δεύτερο αντίσωμα (συζευγμένο) HRP H 2 O 2 + DAB/luminol + Ανίχνευση της πρωτεΐνης Φίλτρο νιτροκυτταρίνης όπου έχουν μεταφερθεί οι πρωτεΐνες Επώαση με το πρώτο αντίσωμα και δέσμευσή του με το αντιγόνο ΑΝΑΛΥΣΗ ΚΑΤΑ WESTERN 23

24 ΑΝΟΣΟΚΑΤΑΚΡΗΜΝΙΣΗ Επιτρέπει την απομόνωση του αντιγόνου Ευαίσθητη δοκιμασία για ανίχνευση παρουσίας αντιγόνου σε κύτταρα ή ιστό Εκχύλισμα κυττάρων αναμιγνύεται με αντίσωμα--προσθήκη συνθετικών σφαιριδίων-- συλλογή με φυγοκέντρηση ή προσθήκη δευτερογενούς αντισώματος συζευγμένου με μαγνητικά σφαιρίδια Κύτταρο με μγν σφρδ προσκολλημένα στην επιφάνειά του μέσω ab 24

25 ΑΝΟΣΟΦΘΟΡΙΣΜΟΣ Φθορίζοντα μόρια απορροφούν φως (διέγερση) και εκπέμπουν σε διαφορετικά μήκη κύματος Σύζευξη αντισώματος με φθοριοχρώματα, το εκπεμπόμενο φως γίνεται ορατό με μικροσκόπια φθορισμού (πηγή υπεριώδους)… Φλουορεσκεϊνη, ροδαμίνη, φυκοερυθρίνη κ.α. συνδέονται με το Fc τμήμα του αντισώματος 25

26 ΚΥΤΤΑΡΟΜΕΤΡΙΑ ΡΟΗΣ ( fluorescence-activated cell sorting ) εναιώρημα ζωντανών κυττάρων + φθορισμο-ενεργοποιούμενος διαλογέας κυττάρων  μέτρηση έντασης φθορισμού & διαχωρισμός κυτταρικών πληθυσμών ~ επιφανειακά αντιγόνα (τυποποίηση λευχαιμιών) 26

27 ΠΡΩΤΕΟΜΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ 1. ΔΙΑΧΩΡΙΣΜΟΣ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ~ ΦΟΡΤΙΟ [ΙΣΟΗΛΕΚΤΡΙΚΗ ΕΣΤΙΑΣΗ] 2.ΔΙΑΧΩΡΙΣΜΟΣ ~ ΜΟΡΙΑΚΗ ΜΑΖΑ ΠΕΔΙΟ ΥΨΗΛΗΣ ΤΑΣΗΣ  ΜΕΤΑΚΙΝΗΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΣΕ ΣΤΑΘΕΡΗΣ ΚΛΙΣΗΣ pH ΚΑΙ ΕΝΤΟΠΙΣΜΟΣ ΣΤΟ ΙΣΟΗΛΕΚΤΡΙΚΟ ΤΟΥΣ ΣΗΜΕΙΟ 27

28 ΑΝΤΙΔΡΑΣΕΙΣ ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑΤΟΣ Προϋποθέσεις: ανιχνεύει Ab στον ορό το σύμπλεγμα Ag-Ab που «καταναλώνει» το συμπλήρωμα δεν είναι ορατό χρειάζεται δείκτης = αιμολυτικό σύστημα ΠΡΟΣΟΧΗ: θετική είναι η αντίδραση που δε δίνει αιμόλυση Αιμολυτικό σύστημα = ερυθρά αιμοσφαίρια προβάτου (Ag) και ορός ζώου που περιέχει Ab έναντι των ερυθρών αιμοσφαιρίων του προβάτου 28

29 ΑΙΜΟΛΥΤΙΚΟ ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑ 29

30 Προϋποθέσεις: Τ λεμφοκύτταρα (τυποποίηση για τα τάξης Ι) και Β λεμφοκύτταρα (τυποποίηση για τα τάξης ΙΙ) πολυκλωνικοί ή μονοκλωνικοί αντι-HLA αντιοροί Μέθοδοι που χρησιμοποιούνται: μικρολεμφοκυτταρική δοκιμασία (ορολογική τυποποίηση) μοριακές μέθοδοι (PCR) μικτή λεμφοκυτταρική αντίδραση (MLR) ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ HLA ΑΝΤΙΓΟΝΩΝ 30