Φυσικοφαρμακευτική Κεφάλαιο 2 ο : ΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟΣ ΣΥΠΛΟΚΩΝ – ΔΕΣΜΕΥΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ Κλεπετσάνης Παύλος, Επίκουρος Καθηγητής Τμήμα Φαρμακευτικής.

Παρουσίαση με θέμα: "Φυσικοφαρμακευτική Κεφάλαιο 2 ο : ΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟΣ ΣΥΠΛΟΚΩΝ – ΔΕΣΜΕΥΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ Κλεπετσάνης Παύλος, Επίκουρος Καθηγητής Τμήμα Φαρμακευτικής."— Μεταγράφημα παρουσίασης:

1 Φυσικοφαρμακευτική Κεφάλαιο 2 ο : ΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟΣ ΣΥΠΛΟΚΩΝ – ΔΕΣΜΕΥΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ Κλεπετσάνης Παύλος, Επίκουρος Καθηγητής Τμήμα Φαρμακευτικής

2 Χρηματοδότηση Το παρόν εκπαιδευτικό υλικό έχει αναπτυχθεί στα πλαίσια του εκπαιδευτικού έργου του διδάσκοντα. Το έργο «Ανοικτά Ακαδημαϊκά Μαθήματα στο Πανεπιστήμιο Πατρών» έχει χρηματοδοτήσει μόνο τη αναδιαμόρφωση του εκπαιδευτικού υλικού. Το έργο υλοποιείται στο πλαίσιο του Επιχειρησιακού Προγράμματος «Εκπαίδευση και Δια Βίου Μάθηση» και συγχρηματοδοτείται από την Ευρωπαϊκή Ένωση (Ευρωπαϊκό Κοινωνικό Ταμείο) και από εθνικούς πόρους.

3 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΣΥΜΠΛΟΚΟΠΟΙΗΣΗ Μεταλλικά σύμπλοκα Οργανικά μοριακά σύμπλοκα Ενώσεις έγκλεισης Μέθοδοι ανάλυσης συμπλόκων ΔΕΣΜΕΥΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ Ισορροπία δέσμευσης Ισορροπία διαπίδυσης – Υπερδιήθηση Υδρόφοβος αλληλεπίδραση Σύζευξη μορίων βιοδραστικών ενώσεων Προσδιορισμός θερμοδυναμικών παραμέτρων από την σταθερά σταθερότητας

4 ΣΚΟΠΟΣ Οι βασικοί στόχοι είναι Α) η μελέτη της συμπλοκοποίησης ανάμεσα σε διάφορες ενώσεις που χρησιμοποιούνται ως έκδοχα σε φαρμακευτικά σκευάσματα και βιοδραστικές ενώσεις Β) οι μέθοδοι προσδιορισμού της στοιχειομετρίας και την σταθεράς σχηματισμού των συμπλόκων Γ) η μελέτη της αλληλεπίδρασης βιοδραστικών ενώσεων με πρωτεϊνες και Δ) η μελέτη της υδρόφοβης αλληλεπίδρασης

5 Κλασσική Θεωρία : μηχανισμός δότη – λήπτη Θεωρία Lewis : αντίδραση οξέος – βάσεως Δότης : ουδέτερο μόριο ή ιοντική ένωση Λήπτης : μεταλλικό κατιόν ή ουδέτερο άτομο Κατάταξη συμπλόκων 1. Σύμπλοκα Μεταλλοϊόντων 2. Οργανικά Μοριακά Σύμπλοκα 3. Ενώσεις Έγκλεισης Διαμοριακές Δυνάμεις : δυνάμεις Van der Waals, δυνάμεις μονίμου και επαγωμένου διπόλου, δεσμοί υδρογόνου

6 Σύμπλοκα Μεταλλοϊόντων 1. Ανόργανα 2. Χηλικά 3. Ολεφινικού τύπου 4. Αρωματικού τύπου α. Pi(π) σύμπλοκα β. Sigma(σ) σύμπλοκα γ. Ενώσεις τύπου “Sandwich” Ανόργανα Σύμπλοκα Υποκαταστάτες (ιόντα ή μικρού μεγέθους ουδέτερα μόρια) Αριθμός σύνταξης ιόντος – Υβριδισμός – Δομή συμπλόκων Σύμπλοκα εσωτερικής και εξωτερικής σφαίρας (θέση ηλεκτρονίων υποκαταστατών ως προς τα μερικά κατηλειμμένα τροχιακά) cis-Platin (ισχυρή αντικαρκινική ένωση)

7 Χηλικά Σύμπλοκα Ενώσεις με δύο ή περισσότερες ομάδες δοτών ηλεκτρονίων – με μεταλλικό κατιόν Δεσμοί: ιοντικοί, καθαροί ομοιοπολικοί, ημιπολικοί Σύμπλοκα EDTA

8 Σχηματισμός χηλικού συμπλόκου: απαιτεί καθορισμένες στερεοχημικές διευθετήσεις στο μεταλλικό κατιόν και στον υποκαταστάτη (cis- και trans- γεωμετρικές μορφές) Cis- υποκαταστάτες: αντικαθίστανται με χηλικό υποκαταστάτη Βιταμίνη Β12, Αιμοπρωτεϊνες: δεν αντιδρούν με χηλικούς υποκαταστάτες λόγω trans- διαθέσιμων θέσεων Φυσικά χηλικά σύμπλοκα: Χλωροφύλλη, Αιμογλοβίνη Αλβουμίνη: μεταφέρει μεταλλοϊόντα, μικρά μόρια στον ορό του αίματος EDTA: πρόσθετο τροφίμων για την κατακράτηση ιόντων σιδήρου, χαλκού – επιταχύνουν την οξείδωση του ασκορβικού οξέος (Ε385 (calcium disodium EDTA, Ε386 (disodium EDTA)) Χλωροφύλλη Αιμογλοβίνη

9 Οργανικά Μοριακά Σύμπλοκα Ασθενείς Διαμοριακές Δυνάμεις – Δεσμοί Υδρογόνου Διμεθυλανιλίνη – 2,4,6-τρινιτροανισόλη Α. αντίδραση εν ψυχρώ: σχηματισμός μοριακού συμπλόκου Ασθενής έλξη ανάμεσα σε δύο αρωματικά μόρια – μη ξεκαθαρισμένος δεσμός – δεν διαχωρίζονται – δύσκολη ταυτοποίηση με φυσικές και χημικές μεθόδους

10 Β. αντίδραση σε υψηλή θερμοκρασία: σχηματισμός ιοντικής ένωσης Οργανικό μοριακό σύμπλοκο: ενέργεια έλξης < 5kcal/mol Όταν η απόσταση > 3 Angstrom : αδύνατος ο σχηματισμός ομοιοπολικού δεσμού – πόλωση μορίου: ιοντική αλληλεπίδραση ή μεταφορά φορτίου (σύμπλοκα μεταφοράς φορτίου) Βενζόλιο – Νιτροβενζόλιο Απόσταση μορίων: 3.3Angstrom Επίδραση στερεοχημικών αλληλεπιδράσεων στον σχηματισμό συμπλόκου

11 Σύμπλοκα Δότη-Δέκτη και Μεταφοράς Φορτίου Διαφορετικό είδος αλληλεπιδράσεων καθορίζει την σταθερότητα τους Φαινόμενο Συντονισμού: σύμπλοκα μεταφοράς φορτίου Δυνάμεις London – Αλληλεπιδράσεις Διπόλου-Διπόλου: σύμπλοκα δότη-δέκτη Νιτροβενζόλιο ---- Εξαμέθυλο-Βενζόλιο Σύμπλοκο δότη-δέκτηΣύμπλοκο μεταφοράς φορτίου

12 Σύμπλοκα Δότη-Δέκτη και Μεταφοράς Φορτίου Αλληλεπίδραση D….A (δότη-δέκτη): ασθενείς δυνάμεις διασποράς και δυνάμεις διπόλου-διπόλου Αλληλεπίδραση D + …..A - (μεταφοράς φορτίου): εμφάνιση θετικού και αρνητικού φορτίου Δυναμική ισορροπία ανάμεσα στις δύο μορφές, ασθενής, με ενδομοριακή ενέργεια σύζευξης: -4.7kcal/mol Ασθενής: σύμπλοκο δότη-δέκτη, δεν εμφανίζονται νέες κορυφές απορρόφησης στα φάσματα, δυνάμεις Van der Waals, αλληλεπιδράσεις διπόλου-διπόλου, δεσμοί υδρογόνου Ισχυρή: σύμπλοκο μεταφοράς φορτίου, εμφανίζονται νέες κορυφές απορρόφησης στα φάσματα (UV/VIS : ορατού-υπεριώδους, φασματοσκοπικές τεχνικές)

13 Οργανικά Μοριακά Σύμπλοκα 1. Σύμπλοκα Κινυδρόνης 2. Σύμπλοκα Πικρικού Οξέος 3. Σύμπλοκα Καφεϊνης και άλλων βιοδραστικών ενώσεων 4. Σύμπλοκα Πολυμερών Σύμπλοκα Κινυδρόνης Μοριακό Σύμπλοκο 1:1 – κρύσταλλοι πράσινου χρώματος Παρασκευή: ανάμιξη ισομοριακών αλκοολικών διαλυμάτων βενζοκινόνης και υδροκινόνης Χρήση: ηλεκτρόδιο για την μέτρηση του pH Επικάλυψη των π-σκελετών των α) ηλεκτρονιακά πτωχού μορίου της κινόνης και β) ηλεκτρονιακά πλουσίου μορίου της υδροκινόνης Μέγιστη επικάλυψη: παράλληλοι οι δακτύλιοι, με σύμπτωση κέντρων, μικρή συνεισφορά δεσμού υδρογόνου

14 Σύμπλοκα Πικρικού Οξέος Ισχυρό Οξύ, δίνει άλατα με ισχυρές βάσεις, με ασθενείς βάσεις μοριακά σύμπλοκα Μοριακό σύμπλοκο Butesin Picrate (2:1): κίτρινη κόνις αδιάλυτη στο νερό, διαλυτή σε οργανικούς διαλύτες, αλοιφή με 1% για εγκαύματα και επώδυνα δερματικά τραύματα Καρκινογόνος δράση: σταθερότητα των μοριακών συμπλόκων των καρκινογενών ενώσεων με το πικρικό οξύ – υποκατάσταση στις καρκινογενείς ενώσεις που μειώνει την συμπλοκοποίηση με το πικρικό οξύ μειώνει και την καρκινογόνο δράση τους Συμμετρικά νιτροβενζόλια σχηματίζουν σταθερότερα σύμπλοκα με τις καρκινογενείς ενώσεις – test για καρκινογένεση

15 Σύμπλοκα Καφεϊνης, Βιοδραστικών ενώσεων Καφεϊνη – Όξινες β.ε. (Sulfonamide, Barbiturates): δυνάμεις διπόλου-διπόλου, δεσμοί υδρογόνου (πολώσιμες καρβονυλικές ομάδες της καφεϊνης – άτομα υδρογόνου των ενώσεων) Δευτερογενής αλληλεπίδραση ανάμεσα στα μη πολικά τμήματα των ενώσεων  σχηματισμός ισχυρών συμπλόκων Σχηματισμός συμπλόκων με αναλογία 1:1 και 1:2 – παρασκευή μορφών με διαφορετικό ρυθμό διαλυτοποίησης και βιοδιαθεσιμότητας σε σύγκριση με την καθαρή βιοδραστική ένωση Συστήματα βραδείας αποδέσμευσης Μεταβολή των οργανοληπτικών χαρακτηριστικών βιοδραστικών ενώεσων (γεύση, οσμή) (φαρμακευτική μορφοποίηση)

16 Σύμπλοκα Πολυμερών Πολυμερή με πυρηνόφιλα άτομα οξυγόνου: σύμπλοκα με βιοδραστικές ενώσεις Polyethylene glycols, Polystyrene, Carboxymethylcellulose και συγγενή πολυμερή Δημιουργία ασυμβατοτήτων: μείωση της δραστικότητας των βιοδραστικών ενώσεων, σχηματισμός ιζήματος, μειωμένη βιολογική απορρόφηση, ανεπιθύμητες φυσικές- χημικές-φαρμακολογικές παρενέργειες (Polyethers: Carbowaxes, Pluronics, Tweens) - Τροποποίηση βιοφαρμακευτικών ιδιοτήτων

17 Ενώσεις Έγκλεισης 1. Τύπου Channel Lattice 2. Στρωματικού τύπου 3. Clathrates 4. Μονομοριακού τύπου και 5. Μακρομοριακού τύπου Παγίδευση του ενός συστατικού του συμπλόκου σε ανοικτό τμήμα της δομής του άλλου συστατικού (με κατάλληλο μέγεθος)  σταθερό σύμπλοκο Τύπου Channel Lattice Κρύσταλλοι με κατάλληλου μεγέθους κανάλια για την προσαρμογή του συμπλεκόμενου μορίου - Διαχωρισμός οπτικών ισομερών (στερεοειδικότητα)

18 Clathrates Δεν σχηματίζονται χημικοί δεσμοί Καθοριστικοί παράγοντες: μέγεθος κοιλότητας και μέγεθος εγκλωβισμένου μορίου Απαιτείται μεγάλη ενέργεια για την διάσπαση τους, παρεμποδίζεται η έξοδος του εγκλωβισμένου μορίου Διαχωρισμός οπτικών ισομερών Warfarin Sodium USP: clathate του νερού, της ισοπροπυλικής αλκοόλης και sodium warfarin (λευκό κρυσταλλικό στερεό (κόνις)) Στρωματικού Τύπου Άργιλος Montmorillonite (κύριο συστατικό του μπετονίτη) εγκλωβίζει: υδρογονάθρακες, αλκοόλες και γλυκόλες ανάμεσα στα στρώματα του πλέγματος της Γραφίτης : συγκρατεί ενώσεις ανάμεσα στα στρώματα του πλέγματος του

19 Κυκλοδεξτρίνες Μονομοριακές ενώσεις έγκλεισης: Κυκλοδεξτρίνες Κυκλικοί ολιγοσακχαρίτες με τουλάχιστον 6 μόρια D-(+) μονάδες γλυκοπυρανόζης που συνδέονται με α-1,4 δεσμούς α-CD (6), β-CD (7), γ-CD (8) Υδρόφιλη επιφάνεια – Υδρόφοβη κοιλότητα α-CD (5), β-CD (6), γ-CD (8) Μικρή διαλυτότητα της β-CD λόγω σχηματισμού ενδομοριακών δεσμών υδρογόνου

20 Γιατί χρησιμοποιούνται οι κυκλοδεξτρίνες ? Αύξηση της διαλυτότητας βιοδραστικών ενώσεων (β.ε.) Αύξηση της χημικής σταθερότητας βιοδραστικών ενώσεων Βελτίωση της διαπερατότητας των β.ε. μέσω των κυτταρικών μεμβρανών Αύξηση της φυσικής σταθερότητας των β.ε. Μετατροπή υγρών β.ε. σε μικροκρυσταλλικά στερεά Πρόληψη των αλληλεπιδράσεων ανάμεσα στις β.ε. και στα έκδοχα Μείωση του τοπικού ερεθισμού μετά από τοπική ή από το στόμα χορήγηση. κ.ά

21 Εγκλωβισμός μορίου κατάλληλου μεγέθους (ολόκληρο ή μερικά), ασθενείς διαμοριακές δυνάμεις και δεσμοί υδρογόνου Αύξηση διαλυτότητας και σταθερότητας βιοδραστικών ενώσεων Sulfonamides, Tetracyclines, Morphine, Aspirin, Benzocaine, κ.ά. Retinoic Acid: διαλυτότητα 0.5mg/l (νερό)  160mg/l (β-CD) Αύξηση ή μείωση δραστικότητας βιοδραστικών ενώσεων Μεταβολή των χαρακτηριστικών αποδέσμευσης, βιοδιαθεσιμότητας και οργανοληπτικών ιδιοτήτων βιοδραστικών ενώσεων β-CD: προκαλεί νεφροτοξικότητα, μικρή διαλυτότητα Τροποποιημένες κυκλοδεξτρίνες (methyl-, hydroxypropyl-, sulfobutylether-)

22 Εμπορικά σκευάσματα συμπλόκων β.ε και κυκλοδεξτρινών CyclodextrinΒιοδραστική ένωσηΕμπορικό όνομα  CD PEG 1 iv infusionProstavastin (Eur.), Caverject (USA)  CD Piroxicam tabletsBrexin (Eur.) HP  CD Intraconazole oral solution and iv soln. Sporanox (Eur. and USA) SBE  CD Ziprasidone maleate im solution Zeldox (Eur.), Geodon (USA) RM  CD Estradiol nasal sprayAerodiol (Eur.)  CD OP-1206 tabletsOpalmon (Japan) HP  CD Diclofenac sodium eye drop solution Voltaren (EUR.)

23 Μακρομοριακές ενώσεις έγκλεισης: Μοριακά κόσκινα Διαχωρισμός μορίων με διαφορετικό μέγεθος Ζεόλιθοι, Δεξτράνες, Silica Gel και συγγενείς ενώσεις Τοποθέτηση των ατόμων σε τρισδιάστατη δομή και δημιουργία καναλιών και κοιλοτήτων Παρασκευή μοριακών κόσκινων με διαφορετικό μέγεθος πόρων

24 Μέθοδοι για την ανάλυση των συμπλόκων Προσδιορισμός: 1. Στοιχειομετρικός λόγος δότη – λήπτη και 2. Σταθερά σταθερότητας (σχηματισμού) Μέθοδοι Προσδιορισμού: 1. Μέθοδος της συνεχούς μεταβολής, 2. Μέθοδος της ποτενσιομετρικής τιτλοδότησης, 3. Μέθοδος της κατανομής, 4. Μέθοδος της διαλυτότητας και 5. Φασματοσκοπική Μέθοδος.

25 Μέθοδος της Συνεχούς Μεταβολής Προσθετική Ιδιότητα: διηλεκτρική σταθερά, συντελεστής μοριακής απορρόφησης, δείκτης διάθλασης – έναντι του γραμμομοριακού κλάσματος του ενός συστατικού Αντίδραση: aM + bL  M a L b Μη αλληλεπίδραση των συστατικών του μίγματος: ευθεία γραμμή Αλληλεπίδραση των συστατικών του μίγματος: δύο ευθύγραμμα τμήματα

26 Το άθροισμα των ολικών συγκεντρώσεων των συστατικών του συμπλόκου παραμένει σταθερό Μέτρηση της απορρόφησης σε ορισμένο μήκος κύματος έναντι του γραμμομοριακού κλάσματος του ενός συστατικού Στο μέγιστο της απορρόφησης: Μεταβολή της απορρόφησης έναντι του γραμμομοριακού κλάσματος του ενός συστατικού όταν σχηματίζεται ένα σύμπλοκο ανάμεσα στα δύο συστατικά με λόγο 2:1

27 Προϋποθέσεις για την εφαρμογή της μεθόδου: 1.το σύστημα να ακολουθεί το Νόμο Beer-Lambert, 2.να σχηματίζεται μόνο ένα σύμπλοκο στις συνθήκες του πειράματος, 3.η ολική συγκέντρωση μετάλλου και υποκαταστάτη να είναι σταθερή και 4.το pH και η ιοντική ισχύς των διαλυμάτων να διατηρείται σταθερή. Μεταβολή της απορρόφησης έναντι του γραμμομοριακού κλάσματος του ενός συστατικού για δύο αρχικές ολικές συγκεντρώσεις των συμπλεκομένων συστατικών – στοιχειομετρία του συμπλόκου 1:1

28 Μέθοδος της Ποτενσιομετρικής Τιτλοδότησης Σχηματισμός συμπλόκου – αποδέσμευση πρωτονίων (μείωση του pH) Καμπύλες τιτλοδότησης διαλύματος ουδέτερου αμινοξέος (καμπύλη Ι) και διαλύματος ουδέτερου αμινοξέος – δισθενούς κατιόντος (καμπύλη ΙΙ).

29 Αντιδράσεις Σχηματισμού – Μαθηματικές Εκφράσεις σταθερών σχηματισμού β: σταθερά σταθερότητας Συνάρτηση σχηματισμού (λόγος της ολικής συγκέντρωσης του δεσμευμένου ουδέτερου αμινοξέος προς την ολική συγκέντρωση των μεταλλοϊόντων στο διάλυμα) - ακέραιες τιμές (1 και 2 σε αυτή την περίπτωση)

30 Καμπύλη σχηματισμού ( έναντι p[A]) για το σύμπλοκο δισθενούς χαλκού – γλυκίνης

31 Μέθοδος της Κατανομής Κατανομή των συστατικών του συμπλόκου σε μη αναμίξιμους διαλύτες – σχηματισμός συμπλόκου στον ένα διαλύτη Σχηματισμός συμπλόκου στοιχειακού Ιωδίου (J 2 ) τα ιόντα J - (σε διάλυμα KJ) Διαλύτες: νερό και διθειάνθρακας σε περίσσεια ιόντων ιωδίου: σχηματισμός πολυϊωδιούχων ιόντων

32 Μέθοδος της Διαλυτότητας Σε διαλύματα διαφορετικής συγκέντρωσης του συμπλεκτικού αντιδραστηρίου προστίθεται περίσσεια φαρμάκου – θερμική εξισορρόπηση – προσδιορισμός ολικής συγκέντρωσης φαρμάκου στην υδατική φάση Διαλυτότητα p-aminobenzoic Acid (PABA) έναντι της συγκέντρωσης καφεϊνης - Σχηματισμός δυσδιάλυτων συμπλόκων ανώτερης τάξεως Διαγράμματα διαλυτότητας παρουσία κυκλοδεξτρινών

33 Φασματοσκοπική Μέθοδος Φασματοσκοπία απορρόφησης στην ορατή και υπεριώδη περιοχή Σύμπλοκα δότη-δέκτη ηλεκτρονίων και Σύμπλοκα μεταφοράς φορτίου Απορρόφηση Ι 2 σε τετραχλωράνθρακα: 520nm Απορρόφηση Ι 2 σε βενζόλιο: 475nm, επιπλέον κορυφή στα 300nm Απορρόφηση Ι 2 σε αιθέρα: μετατόπιση μέγιστου στην υπεριώδη περιοχή και επιπλέον κορυφή Το Ι 2 ως δέκτης ηλεκτρονίων ενώ το βενζόλιο και ο αιθέρας ως δότης ηλεκτρονίων Μεγαλύτερη μετατόπιση μέγιστου όταν ο δότης ηλεκτρονίων γίνεται ισχυρότερος

34 Υπολογισμός σταθεράς σχηματισμού: Εξίσωση Benesi-Hildebrand : A 0, D 0 : αρχικές συγκεντρώσεις δέκτη και δότη ηλεκτρονίων αντίστοιχα, Α: απορρόφηση στο μέγιστο για την νέα κορυφή του συμπλόκου μεταφοράς φορτίου ε: μοριακή απορροφητικότητα του συμπλόκου μεταφοράς φορτίου Κ: σταθερά σταθερότητας Γραφική Παράσταση: Α 0 /Α έναντι του 1/D 0  Κλίση = 1/(Κε), Τεταγμένη επί την αρχή = 1/ε

35 Επίδραση της β-κυκλοδεξτρίνης στην απορρόφηση του Methyl Orange σε pH = 1

36 Προσδιορισμός θερμοδυναμικών παραμέτρων από τον υπολογισμό της σταθεράς σχηματισμού σε διάφορες θερμοκρασίες Υπολογισμός της ΔΗ 0 από την κλίση της ευθείας στην εξίσωση Arrhenius (logK έναντι 1/T) Άλλες Μέθοδοι: 1 Υπέρυθρη Φασματοσκοπία, 2. Φασματοσκοπία Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισμού (NMR), 3. Πολαρογραφία, 4. Κινητική χημικών αντιδράσεων, 5. Περίθλαση Ακτίνων-Χ, 6. Περίθλαση Ηλεκτρονίων, Κυκλικός Διχρωϊσμός, κ.λ.π

37 Δέσμευση βιοδραστικών ενώσεων από πρωτεΐνες Δέσμευση β.ε.  μεταβολή της δράσης των: Α) διευκολύνει την κατανομή τους στον οργανισμό, Β) αδρανοποιεί προσωρινά την βιοδραστική ένωση αποτρέποντας να φθάσει μεγάλη ποσότητα του στον υποδοχέα και Γ) επιβραδύνει την απέκκριση τους. Αλληλεπίδραση πρωτεϊνών – βιοδραστικής ένωσης προκαλεί: Α) μείωση της μεταφοράς ορμονών λόγω ανταγωνισμού, Β) μεταβολές στην διαμόρφωση της πρωτεΐνης και Γ) σχηματισμό βιολογικά ενεργού συμπλόκου β.ε.-πρωτεΐνης Ποσοστό δέσμευσης: 95%  ελεύθερο: 5% Ποσοστό δέσμευσης: 90%  ελεύθερο: 10% αύξηση κατά 100% (μείωση χρόνου δράσης, πιθανά τοξικές παρενέργειες)

38 Σημαντικότερη πρωτεΐνη για την μεταφορά βιοδραστικών ενώσεων: Αλβουμίνη, μεγάλη συγκέντρωση σε σύγκριση με τις άλλες πρωτεΐνες, δεσμεύει εξίσου όξινες, βασικές και ουδέτερες β.ε., αντιστρέψιμη δέσμευση (προφύλαξη από τις διεργασίες μεταβολισμού και απέκκρισης) α 1 -όξινη γλυκοπρωτεΐνη, μεγάλη τάση δέσμευσης βασικών β.ε. Περιεκτικότητα του αίματος σε πρωτεΐνες ανά 100ml: Ολική Πρωτείνη: 6.72g ~4.0g Αλβουμίνη, 2.3g globulins, 0.24g Fibrinogen

39 Δεσμευτική δράση της αλβουμίνης  ΜΒ = 67  2 kD, περιέχει 569 – 613 αμινοξέα, ισοηλεκτρικό σημείο σε pH = 4.9 με συνέπεια να είναι αρνητικά φορτισμένη σε pH = 7.4  Μεταφέρει εξίσου όξινες, βασικές και ουδέτερες β.ε. : διαφορετικός τρόπος και διαφορετική περιοχή δέσμευσης της β.ε.  Περιοχή Lys-Ala-Try-Ala-Val-Ala-Arg: υδρόφοβη περιοχή με κατιονική ομάδα στα άκρα της δεσμεύει οργανικά ανιόντα, η ε-ομάδα της λυσίνης είναι το σημείο σύνδεσης των οργανικών ανιόντων  Η παραπάνω υδρόφοβη περιοχή ή υδρόφοβες πλευρικές αλυσίδες δεσμεύουν ουδέτερες β.ε. μέσω υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων  Δέσμευση όξινων β.ε.: ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις (αρνητικά φορτισμένη) και υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις, πιθανή επίδραση στον αριθμό θέσεων δέσμευσης των οργανικών ανιόντων

40 Ορισμένες β.ε. δεσμεύονται με βάση την λιποφιλικότητα τους παρά μέσω ηλεκτροστατικών αλληλεπιδράσεων Φαινολικά παράγωγα δεσμεύονται κύρια με βάση τον υδρόφοβο χαρακτήρα του υποκαταστάτη παρά την παρουσία υδροξυλίου Παράγωγα πενικιλλίνης και Φαινοθιαζίνες: την δέσμευση καθορίζουν τα υδρόφοβα χαρακτηριστικά των πλευρικών ομάδων Η δέσμευση β.ε. στην αλβουμίνη είναι διεργασία συγκρίσιμη με την κατανομή των μορίων της β.ε. ανάμεσα στην υδατική και την μη πολική φάση Οι υδρόφοβες θέσεις δεν είναι προσχηματισμένες Ορισμένες ενώσεις μπορούν να προκαλέσουν μεταβολές στην διαμόρφωση της αλβουμίνης και να δημιουργήσουν υδρόφοβες περιοχές

41 Ισορροπία Δέσμευσης Αντίδραση β.ε., D, με την ελεύθερη θέση στην πρωτεΐνη, P, Ολική Πρωτεϊνη: r: mol δεσμευμένης β.ε. ανά mol ολικής πρωτεΐνης ή ποσότητα (mg) δεσμευμένης β.ε. ανά g πρωτεΐνης - παρόμοια μορφή με την εξίσωση Langmuir

42 μετατροπή σε γραμμική σχέση: (ισχύει για ενός μόνο είδους θέσης δέσμευσης) Γράφημα Scatchard για τη δέσμευση της ένωσης bis-hydroxy-coumarin από ανθρώπινη αλβουμίνη στους 20 και 40  C.

43 Εάν υπάρχουν ν ανεξάρτητες θέσεις δέσμευσης τότε: Διαφορετικός τρόπος γραφής της παραπάνω εξίσωσης: Το γράφημα Klotz παρουσιάζει σημαντικές αποκλίσεις σε υψηλές συγκεντρώσεις ελεύθερης β.ε. – τα πειραματικά σημεία σε χαμηλές συγκεντρώσεις έχουν σημαντική επίδραση στην μορφή της εξίσωσης Στο γράφημα Scatchard δεν εμφανίζεται το παραπάνω πρόβλημα

44 Απόκλιση από την γραμμικότητα στο γράφημα Scatchard δείχνει ότι υπάρχουν περισσότερες από ενός είδους θέσεις δέσμευσης (παραπάνω διάγραμμα) Οι παραπάνω σχέσεις δεν μπορούν να χρησιμοποιηθούν όταν η φύση και η ποσότητα της πρωτεΐνης δεν είναι γνωστές – χρησιμοποιείται η τροποποιημένη εξίσωση: Γραφική παράσταση του όρου [D b ] / [D f ] έναντι του όρου [D b ]: προσδιορίζεται η σταθερά Κ = -κλίση και οι θέσεις δέσμευσης από την τεταγμένη επί την αρχή

45 Μέθοδοι προσδιορισμού της ποσότητας βιοδραστικής ένωσης που δεσμεύεται από πρωτεΐνη Ισορροπία Διαπίδυσης, Υπερδιήθηση, Δυναμική Διήθηση, Ηλεκτροφόρηση, Διήθηση μέσω γέλης (gel filtration) Μαγνητικός Πυρηνικός Συντονισμός (NMR) κ.ά.

46 Μέθοδος της Ισορροπίας Διαπίδυσης Χρησιμοποιείται ημιπερατή μεμβράνη για τον διαχωρισμό των ελεύθερων και των δεσμευμένων μορίων της βιοδραστικής ένωσης Ανάδευση, ρύθμιση του pH και της ιοντικής ισχύος, θερμοστάτηση Ίδια ποσότητα πρωτεΐνης – διαφορετική ποσότητα βιοδραστικής ένωσης Σφάλμα από την πιθανή δέσμευση βιοδραστικής ένωσης από την ημιπερατή μεμβράνη και από ωσμωτικά φαινόμενα Δέσμευση β.ε. από την πρωτεΐνη  συγκέντρωση β.ε. στο εσωτερικό της ημιπερατής μεμβράνης > σε σύγκριση με το εξωτερικό της Χρονοβόρα Μέθοδος Μέθοδος της Υπερδιήθησης Παρόμοια τεχνική με την ισορροπία διαπίδυσης, εφαρμογή πίεσης ή φυγοκέντρησης για την απομάκρυνση των ελεύθερων μορίων της β.ε. και του διαλύτη από την ημιπερατή μεμβράνη Ποσοτικός προσδιορισμός της ελεύθερης βιοδραστικής ένωσης με κατάλληλη αναλυτική τεχνική - Γρήγορη μέθοδος

47 Μέθοδος της Δυναμικής Διήθησης Σχετικά γρήγορη μέθοδος, απαιτεί μικρή ποσότητα πρωτεΐνης, εφαρμόζεται εύκολα σε μελέτες αναστολής δέσμευσης β.ε. σε πρωτεϊνη Αρχή της μεθόδου: ταχύτητα απομάκρυνσης της β.ε. από το δοχείο διάλυσης είναι ανάλογη της συγκέντρωσης της ελεύθερης β.ε. Μεμβράνη διάλυσης (ορισμένος μικρός όγκος διαλύματος β.ε. ή β.ε. – πρωτεΐνης) σε ρυθμιστικό διάλυμα – θερμοστάτηση - ανάδευση Λήψη δειγμάτων – αντικατάσταση με ίσο όγκο ρυθμιστικό διάλυμα Υπολογισμός της σταθεράς Κ: από την κλίση στην γραφική παράσταση του log[D t ] έναντι του χρόνου απουσία πρωτεΐνης Υπολογισμός της συγκέντρωσης της ελεύθερης βιοδραστικής ένωσης, [D f ]: γνωρίζοντας την σταθερά Κ και τον όρο –d[D t ]/dt

48 Μεταβολή της συνολικής ποσότητας της β.ε. στο εσωτερικό της ημιπερατής μεμβράνης απουσία (Ι) και παρουσία (ΙΙ) της πρωτεΐνης Ο προσδιορισμός της κλίσης στις καμπύλες Ι και ΙΙ για τον υπολογισμό της ελεύθερης συγκέντρωσης της β.ε., [D f ], γίνεται με την προσαρμογή κατάλληλης εξίσωσης:

49 Υδρόφοβη Αλληλεπίδραση Τάση των υδρόφοβων μορίων ή τμημάτων τους να αποφεύγουν τα μόρια του νερού και να σχηματίζουν συσσωματώματα (ανάλογα των μικυλλίων) Δομή νερού – δεσμοί υδρογόνου Υδρόφοβη αλληλεπίδραση: έλξη υδρόφοβων τμημάτων μορίων (δεν σχηματίζεται δεσμός)

50 Αντιτίθεται η θερμική κίνηση των μορίων καθώς και η παρουσία ιονισμένων ομάδων στα μόρια: αυξάνει τις ηλεκτροστατικές απώσεις στην επιφάνεια των συσσωματωμάτων Ευνοείται θερμοδυναμικά: αυξάνει η εντροπία των μορίων του νερού που συνοδεύει την σύζευξη των μη πολικών μορίων που πιέζουν προς τα έξω τα μόρια του νερού Διατήρηση σχήματος στις σφαιροειδείς πρωτεΐνες Ο σχηματισμός των ευνοείται από την: 1. αύξηση του μεγέθους του μη πολικού τμήματος του μορίου, 2. μείωση της θερμοκρασίας (εξώθερμη διαδικασία, γιατί?) και 3. αύξηση της αλατότητας του υδατικού μέσου. Αλληλεπίδραση β.ε. με τις πρωτεΐνες μέσω υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων μεταβάλλει: τον μεταβολισμό, την απέκκριση και την βιολογική δραστικότητα των βιοδραστικών ενώσεων

51 Σύζευξη Μορίων βιοδραστικών ενώσεων Σχηματισμός διμερών, τριμερών ή ανώτερης συσσωματωμάτων Μεγάλος βαθμός σύζευξης  μικύλλια και εξαρτάται κύρια από την φύση του μορίου Μεταβάλει την διαλυτότητα, διάχυση, μεταφορά μέσω των μεμβρανών και την θεραπευτική δράση της βιοδραστικής ένωσης Ινσουλίνη: σχηματίζει συσσωματώματα (εξαρτώνται από την συγκέντρωση του μονομερούς) – αρχικά σχηματίζεται διμερές  σχηματισμός συσσωματωμάτων ανώτερης τάξης Ευνοείται από την μεγάλη συγκέντρωση ινσουλίνης, αποβολή κρυσταλλικής ινσουλίνης – προσθήκη μικρής ποσότητας ουρίας (1-3mg/ml) αναστέλλει τον σχηματισμό συσσωματωμάτων Ουρία: διασπά την παγοειδή δομή του νερού, σχηματίζει δεσμούς υδρογόνου με τα μόρια του νερού και περισσότερο ανοικτή πλεγματική δομή

52 Υπολογισμός Θερμοδυναμικών Παραμέτρων από την Σταθερά Σταθερότητας Μεταβολή της πρότυπης ελεύθερης ενέργειας για την συμπλοκοποίηση: Μεταβολή της πρότυπης ενθαλπίας: Μεταβολή της πρότυπης εντροπίας:

53 Συνεισφορά των μεγεθών ΔH 0 και ΔS 0 στην ΔG 0 (1) Αύξηση της σταθεράς σταθερότητας: ΔH 0, ΔS 0 γίνονται περισσότερο αρνητικές Αύξηση της δέσμευσης δότη – λήπτη: ΔH 0 περισσότερο αρνητική Αύξηση της εκλεκτικότητας των θέσεων αλληλεπίδρασης ή δομικοί περιορισμοί: ΔS 0 περισσότερο αρνητική Αρνητική τιμή στο ΔG 0 παρότι ΔS 0 αρκετά αρνητικό ΔS 0 > 0 : ηλεκτροστατικές και υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις λόγω διατάραξης της παγόμορφου δομής του νερού που περιβάλλει την βιοδραστική ένωση και την πρωτεΐνη Θετική επίδραση της μείωσης της διηλεκτρικής σταθεράς στην δέσμευση βιοδραστικής ένωσης – πρωτεΐνης Για αυθόρμητη μεταβολή ισχύει ΔG 0 <0

54 Συνεισφορά των μεγεθών ΔH 0 και ΔS 0 στην ΔG 0 (2) Είδος Αλληλεπίδρασης Πρόσημο ΔH 0 Πρόσημο ΔS 0 Παράγοντας που ευνοεί το ΔG 0 Ηλεκτροστατική~ 0++ ΔS 0 Υδρόφοβη++Μεγάλο + ΔS 0 Χηλική-++ ΔS 0 και / ή ΔH 0 Δότη – Λήπτη---ΔH 0 Ξεδίπλωμα Πρωτεϊνών +++ ΔS 0

55 ΔΗ 0 : δυνάμεις Van der Waals ή δεσμούς υδρογόνου Οι παραπάνω δυνάμεις μαζί με την υδρόφοβη αλληλεπίδραση ευνοούν τον σχηματισμό του συμπλόκου Η σταθερά στην εξίσωση υπολογισμού της πρότυπης ενθαλπίας μπορεί να αντικατασταθεί με τον όρο ΔS 0 /2.3R οπότε:

56 Σημείωμα Αναφοράς Copyright Πανεπιστήμιο Πατρών, Κλεπετσάνης Παύλος «ΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟΣ ΣΥΠΛΟΚΩΝ – ΔΕΣΜΕΥΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ». Έκδοση: 1.0. Πάτρα 2015. Διαθέσιμο από τη δικτυακή διεύθυνση: https://eclass.upatras.gr/courses/PHA1615/

57 Σημείωμα Αδειοδότησης Το παρόν υλικό διατίθεται με τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Αναφορά, Μη Εμπορική Χρήση Παρόμοια Διανομή 4.0 [1] ή μεταγενέστερη, Διεθνής Έκδοση. Εξαιρούνται τα αυτοτελή έργα τρίτων π.χ. φωτογραφίες, διαγράμματα κ.λ.π., τα οποία εμπεριέχονται σε αυτό και τα οποία αναφέρονται μαζί με τους όρους χρήσης τους στο «Σημείωμα Χρήσης Έργων Τρίτων». [1] http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/ Ως Μη Εμπορική ορίζεται η χρήση: που δεν περιλαμβάνει άμεσο ή έμμεσο οικονομικό όφελος από την χρήση του έργου, για το διανομέα του έργου και αδειοδόχο που δεν περιλαμβάνει οικονομική συναλλαγή ως προϋπόθεση για τη χρήση ή πρόσβαση στο έργο που δεν προσπορίζει στο διανομέα του έργου και αδειοδόχο έμμεσο οικονομικό όφελος (π.χ. διαφημίσεις) από την προβολή του έργου σε διαδικτυακό τόπο Ο δικαιούχος μπορεί να παρέχει στον αδειοδόχο ξεχωριστή άδεια να χρησιμοποιεί το έργο για εμπορική χρήση, εφόσον αυτό του ζητηθεί

58 Τέλος Ενότητας