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Ligation Transformation (DNA prep.) 생화학 및 분자생물학실험 5 주차
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1. Purpose - Ligation - Transformation 2. Introduction & theory - Ligation - X-gal(Blue white selection) - Transformation 종류 및 방법 - Competent cell 3. Materials & method Content
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Experiment Scheme (gene cloning)
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T4 DNA ligase 를 이용하여 재조합 DNA 완성의 마지막 단계인 Ligation (vector 와 insert 연결 ) 을 진행한다. Purpose _ Ligation
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재조합 DNA 를 증폭시키기 위해서 competent cell 에 Transformation 하여 selection 한다. Purpose_ Transformation
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1. Ligation 2. Transformation Materials & Method
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Ligation 1. Heating block 을 25 ℃로 맞춘다. 2. Autoclave 된 e-tube 에 reaction mixture 를 만든다. 3. 25 ℃ heating block 에서 2 시간 ligation 한다. (4 ℃, Over Night 가능 ) Heating block, T4 DNA ligase, 10X T4 DNA ligase buffer, Vector(pRSET A), insert(Lac Z), LB, LB plate, competent cell (DH5 α ), ice, spreader, incubator, alcohol lamp, centrifuge MaterialsVol. (ul) Vector (50 ng/ul)1 Insert (50 ng/ul)3 10X T4 ligase buffer2 T4 DNA ligase1 DW13 Total20
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1. Heating block 을 42 ℃로 맞추고, ampicillin 이 첨가된 LB plate 를 37 ℃ pre-incubation 2. Deep freezer 에 보관 중인 DH5 α 를 꺼내어 ice 에서 녹인다 3. Alcohol lamp 를 켜고 ligation 한 DNA 를 1 μl 따서 DH5α 에 첨가한다 (pipetting) 4. 15 min 이상 ice 에 꽂아둔다 5. 42 ℃에서 1 min 30 sec heat shock 한다 6. Ice 에 2 min 꽂아둔다 7. Autoclave 된 LB broth medium 을 200 μl 따서 첨가한다 8. 37 ℃에서 1 hr incubation 한다 9. 37 ℃ incubator 에 넣어둔 ampicillin LB plate 에 8. 에서 준비한 cell 을 따서 spreading 한다 10. 37 ℃에서 overnight incubation 한다 다음 날 colony 확인 Transformation
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